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摘要：目的 建立人α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-SYN)A30P突變型轉(zhuǎn)基因大鼠的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型。方法 利用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建過表達(dá)野生型α-SYN載體pLKO-CMV-α-SYN-WT-P2A-GFP及α-SYN A30P突變載體pLKO-CMV-α-SYN-A30P-P2A-GFP,分別轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,瞬時轉(zhuǎn)染24 h后WB檢測α-SYN的表達(dá)水平。之后經(jīng)慢病毒包裝、濃縮,利用立體定位技術(shù)分別對大鼠中腦黑質(zhì)致密部注射病毒稀釋液,過表達(dá)α-SYN野生型和A30P突變型的慢病毒顆粒。免疫熒光染色檢測α-SYN和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的分布情況,并觀察中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的變化。Rotating rod實(shí)驗(yàn)評價注射A30P慢病毒大鼠的行為改變情況。結(jié)果 野生型和突變型A30P的基因表達(dá)載體在293FT細(xì)胞內(nèi)能夠高表達(dá)α-SYN蛋白。TH免疫熒光結(jié)果顯示:與病毒稀釋液組相比,過表達(dá)α-SYN野生型和A30P突變型大鼠均能導(dǎo)致中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的減少,而α-SYN A30P慢病毒注射組的中腦黑質(zhì)神經(jīng)元缺失的更多,具有顯著性差異。對A30P轉(zhuǎn)基因大鼠腦部神經(jīng)元缺失部位進(jìn)行免疫熒光發(fā)現(xiàn),該區(qū)域TH染色幾乎呈陰性,α-SYN蛋白出現(xiàn)大量聚集,該結(jié)果表明腦部神經(jīng)元的消失同時伴隨著α-SYN蛋白的聚集及TH表達(dá)的劇烈減少,進(jìn)一步揭示過表達(dá)α-SYN A30P可以導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的減少和退化。此外,rotating rod實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)α-SYN A30P大鼠表現(xiàn)出明顯的進(jìn)行性運(yùn)動能力障礙。結(jié)論 通過慢病毒系統(tǒng)建立了人α-SYN A30P突變型轉(zhuǎn)基因大鼠的PD模型,為PD發(fā)病機(jī)制的研究及藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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