【關鍵詞】 結核分枝桿菌 ; 基因;突變 ; 耐藥性

結核病是嚴重危害人民身體健康的傳染性疾病。耐藥結核桿菌尤其是耐多藥結核桿菌(MDR-TB)的出現和傳播是導致結核病發病率升高的重要原因。結核桿菌無法通過質粒的介導從其他細菌獲得耐藥性，因此染色體介導的耐藥是結核桿菌產生耐藥的分子基礎。目前對結核桿菌耐藥機制的研究主要集中在藥物作用靶位及相關基因的突變上。現就結核桿菌對主要的抗結核藥物的耐藥機制的研究進展做一綜述。

1 異煙肼(INH)

有研究表明，結核桿菌耐INH涉及多個基因變化：katG，inhA，kasA，ndh及oxyR-ahpC基因連接區。

1. 1 katG基因 即過氧化氫酶一過氧化物酶(catalase-peoxidase)的編碼基因。異煙肼被結核桿菌內的過氧化氫酶-過氧化物酶活化，活化產物作用于enoyl-ACP還原酶(屬于脂酸合成酶II系統，可促進短鏈脂肪酸合成脂酸)，抑制桿菌酸和細胞壁生物合成。katG基因的上游相隔44個堿基與furA基因(一種結核桿菌鐵調控蛋白編碼基因，可能為katG基因的啟動子，并調控其表達)相連，下游相隔2794個堿基與embC基因相連，全長2223個核苷酸。引起INH耐藥性的主要原因是katG基因的點突變、缺失、插入，完全缺失僅占INH耐藥菌株的7%～24%。katG基因常見的點突變是315位AGC→ACC和463位CGG→CTG。katG基因315位突變通常會造成過氧化氫一氧化物酶活性的降低，造成中等水平到高水平的耐藥[1]。Coll等[2]對6l株異煙肼耐藥株進行分析，其中55%分離株檢測到katG基因突變，最常見的變異是第315位密碼子(占32%)，這些菌株顯示了高水平的耐藥。此外還可見katG基因104、108、138、148位等突變。各基因序列改變的具體位點與katG酶的活性以及INH耐藥性的關系還有待進一步的研究。

1. 2 inhA基因 即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依賴的enoyl-ACP還原酶的編碼基因。活化的INH(異煙堿酰基)與inhA酶(enoyl-ACP還原酶)活性部位的輔因子NAD結合，生成高親和力的共價化合物，而削弱了NADH和enoyl-ACP還原酶的親和力，干擾了脂酸的合成，進而發揮抗菌作用。inhA基因突變約占異煙肼臨床耐藥株的10%-35%[4] 。耐藥的發生可由于inhA結構基因突變造成INH與NADH的親和力下降，或是inhA啟動子-15的C→T的點突變[3]以及inhA調節序列突變可能創造一個強有力的啟動，使inhA蛋白過度表達從而提高對INH活性形式所需的濃度，引起對INH耐藥[5]。inhA基因的突變伴隨低水平INH耐藥性，和katG基因不同，katG突變后耐藥水平的高低取決于突變對過氧化氫一過氧化物酶活性的影響，突變導致酶活性完全喪失可引起高度INH耐藥。InhA的突變不僅引起INH耐藥，還會引起結構相近的二線抗結核藥物乙硫異煙(ETH)的耐藥性[6]。

1. 3 oxyR-ahpC oxyR基因表達的蛋白是氧壓的感應器又是基因轉錄的活化劑，參與調節katG和ahpC基因(編碼烷基過氧化氫還原酶，參與氧化-應激應答[7])的表達。而結核桿菌的oxyR基因發生大量移碼突變和缺失，沒有活性，當Deretic[8]等用突變體與攜帶具有活性的oxyR-ahpC基因的質粒組成一個重組體，結果對異煙肼耐藥，因此MTB對INH敏感可能是由于oxyR基因的異常化。同時Dhandayuthapani[9]等發現部分katG突變的耐異煙肼分離株存在ahpC啟動子(存在于oxyR-ahpC區)突變，增強ahpC表達來補償過氧化氫酶一過氧化物酶的缺乏，從而抵抗宿主巨噬細胞的氧化。因此可將ahpC突變作為katG基因變異的標志，但二者不是一種簡單直接的因果關系[10]。

1. 4 kasA和ndh kasA基因編碼β-酮酰基載體蛋白合成酶，參與分枝菌酸生物合成，是INH耐藥的另一個相關基因，全長1251bp，編碼471個氨基酸，其中最常見的突變是第312位點。但在大約19%敏感株中也發現同樣突變，推斷該基因在異煙肼耐藥中表現為多態性[11]。katG、inhA、ahpC、oxyR和kasA基因突變并不能解釋所有的異煙肼耐藥問題。lee[12]等報道了一個與結核桿菌對異煙肼耐藥有關的基因ndh，即編碼NADH脫氫酶基因，ndh基因的突變使NADH脫氫酶活性受到抑制，使NADH/NAD 比率升高，抑制INH的過氧化，也阻止異煙酰乙酸NADH 與InhA酶的結合，從而使細菌產生耐藥性，具體機制還有待進一步研究。

2 利福平

利福平作用于結核桿菌DNA依賴的RNA聚合酶亞基β亞單位，從而抑制mRNA的轉錄。rpoB基因是結核桿菌DNA依賴RNA聚合酶β亞單位的編碼基因，全長3543個堿基.當其中長81個堿基的核心區域-- 耐利福平決定區(RRDR)發生突變時，包括點突變或短的插入、缺失突變等，使DNA依賴性RNA聚合酶B亞單位酶結構改變，利福平不能與細菌RNA聚合酶β亞單位結合而表現為耐藥。在結核桿菌DNA依賴的RNA聚合酶亞基β亞單位氨基酸序列中有3個短區域與耐利福平相關：507aa-534aa、567aa-574aa、687aa[13]。95%左右的RFP耐藥菌株的基因突變都集中在507～533位的27個氨基酸(81bp)組成的區域，這一突變區被稱為利福平耐藥決定區(rifampicin resistance determing region，RRDR)。其中以編碼531位氨基酸的堿基TCG→TTG的和編碼526位氨基酸的堿基CAC→TAC的突變最常見，因此這個區域的突變可作為一種檢測結核桿菌耐RFP簡易、快速的方法。在臨床分離的MDR-MTB中，86%的耐藥株有rpoB基因的突變，因此認為rpoB基因的突變是MDR-MTB菌株的標志。

已知RFP耐藥菌的rpoB基因有14種突變，其中9種突變對利福布丁和利福噴丁交叉耐藥。531、526位點突變株對所有利福霉素類藥物均高度耐藥。

3 氨基糖苷類

氨基糖苷類主要作用于結核桿菌的核糖體，抑制蛋白質合成。耐鏈霉素(SM)的結核桿菌，其編碼核糖體16 SrRNA的rrs基因與編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因發生突變，降低藥物結合到核糖體上的能力，使之對SM耐藥[14]。rpsL基因突變是鏈霉素耐藥的主要機制，編碼第43位氨基酸的堿基 A→G的突變，是最常見的突變位點[15]。rrs基因突變點為512、513位的堿基插入，這些位置的堿基發生突變可導致高水平的耐藥，rrs基因突變主要集中于530環區和915區，此兩區均為16SrRNA和S12蛋白結合并相互作用的場所。耐丁胺卡那(AK)和卡那霉素的結核桿菌中，rrS基因突變率為67. 4%，最常見的突變是1401位點A→G單堿基置換(60. 5%)，少數分離株為(1402位)C→T或A、(1484位)G→T，這些突變主要發生于高水平耐藥株，32. 6%的耐卡那霉素分離株未發現rrS基因突變，可能還存在其他耐藥機制。卷曲霉素(CPM)和紫霉素(VIO)在結構上相似，結核桿菌對CPM和VIO耐藥是由于tlyA基因(編碼rRNA修飾酶2’-O -甲基轉移酶)和rrS基因突變所致，其中 tlyA基因突變是耐藥性產生的重要原因。卷曲霉素、紫霉素、卡那霉素和AK之間存在交叉耐藥性[16]。

4 吡嗪酰胺

吡嗪酰胺(PZA)在細胞內酸性環境中經吡嗪酰胺酶作用轉變成吡嗪酸而起殺菌作用。編碼吡嗪酰胺酶的pncA基因突變致使酶活性丟失是其主要的耐藥機制。pncA基因全長561bp，其突變分布在啟動子區域和結構基因的各個位置。Hou等報道耐藥結核菌的pncA基因有54位、118位、368位、501位的點突變，起始密碼有一8bp丟失，88位ser→終止密碼子等突變，而Park等報道在起始密碼子一11上游區A與G點突變是最常見的類型，Endoh等[17]報道在382位有一8bp丟失，另見29位、11位突變。還有一些在102位發現無義突變(C→G)。但在敏感菌株中也發現了一些pncA基因突變，如第6位G和第300位CT的沉寂突變[18]。pncA基因突變的特點不一，是否與地理區域有關，尚需進一步探討。另28%的PZA耐藥菌的耐藥機制仍在研究中，如吡嗪酸在菌體的轉移等[19]。

5 乙胺丁醇(EMB)

EMB主要作用于阿拉伯糖基轉移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影響細胞壁分枝菌酸一阿拉伯半乳聚糖一肽聚糖復合物的形成。當阿拉伯糖基轉移酶編碼基因(emb)的操縱子突變致氨基酸替換，可改變藥物與酶的相互作用而導致耐藥。該操縱子由embA、embB和embC三個基因組成，其中embB基因，編碼一個糖基轉移酶，embB基因突變導致糖基轉移酶結構改變，影響了EMB和糖基轉移酶的結合而產生耐藥，其中第306位密碼子的錯義突變最為常見[20]，該位點密碼子突變具有相當的普遍性，可用于快速測定耐乙胺丁醇菌株。embC基因394位密碼子和738位密碼子的突變、embA中462位密碼子、913位密碼子等以及位于embC-embA之間的區域內的第1位、l2位和l6位密碼子的突變均被檢測到，但這些突變與耐藥性之間的確切關系還要做進一步研究 [21]。

6 氟喹諾酮類藥

氟喹諾酮類藥物(FQ)是復治病例主要的抗結核藥物之一，其作用靶位是結核桿菌的DNA旋轉酶，DNA旋轉酶由gyrA和gyrB兩種基因編碼的兩個A亞單位和兩個B亞單位組成。FQ主要作用gyrA基因編碼的A亞基，可以抑制細菌染色體的DNA復制，而編碼的gyrA基因發生突變則導致藥物結合位點構象改變，以致產生耐藥性。喹諾酮類耐藥結核菌中，突變大多發生在gyrA基因保守區67～106位的密碼子區，常見有94位GAC→GCC或CAC或TAC，90位GCC→GTG的突變[22]。gyrA基因突變與藥物濃度和結構有關，gyrB基因突變可能改變了胞內藥物的蓄積，而呈現低度耐藥。

7 大環內酯類藥物

大環內酯類藥物作用于50S核蛋白體亞單位上，抑制細菌蛋白合成及核肽鏈的延伸而發揮抗菌作用。耐藥結核桿菌染色體存在erm基因，其編碼產生的酶能將核蛋白體亞基的23SrRNA上一個特異性腺嘌呤殘基N6位甲基化，改變了核糖體構象，降低了細菌與大環內酯類的親和力[23]。

結核分枝桿菌H37Rv的Tap基因(Rv1258)編碼結核分枝桿菌的膜外排泵，約有12個跨膜區域和不同的基序特征，可能與大環內酯類抗生素耐藥機制相關。

8 乙硫異煙胺及環絲氨酸

乙硫異煙胺可在結核桿菌內誘導產生4一煙醇產物，能抑制合成結核菌酸必需的結核菌酸合成酶。現已證實結核分枝桿菌基因ethA和ethR與乙硫異煙胺耐藥有關：ethA編碼的蛋白屬于含黃素單氧化酶家族，催化激活乙硫異煙胺;ethR基因編碼的阻抑物屬于轉錄調節器TetR/CamR家族.負性調節ethA的表達[24]。inhA基因突變也可引起乙硫異煙胺耐受。

環絲氨酸(cycloserine)可通過抑制丙氨酸消旋酶(Al)及合成酶(Dd1)，抑制細菌細胞壁粘肽(肽聚糖)的合成，致結核分枝桿菌細胞壁缺損，減弱其耐酸能力，有殺菌和抑菌作用。谷氨酸脫羧酶基因(glutamate decarboxylase，gadA)和D一丙氨酸消旋酶(D-alanine racemase，alrA)基因的突變，也會影響細菌對環絲氨酸的敏感性[25]，具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，結核菌對某種藥物產生耐藥性時，可能有多個基因介入，而一個基因的突變也可能影響到好幾種藥物的耐藥性，由此說明了耐藥基因的交叉性和互聯性。因此積極開展耐多藥結核病耐藥機制的研究，積極開展抗結核新藥的研制，加強結核病患者的治療和管理，對控制耐多藥結核病極有意義。