【關鍵詞】 整合子;大腸埃希菌;水平轉移

整合子可特異性捕獲或切除基因盒導致基因盒的移動，也可在接合性質粒、轉座子、整合型噬菌體或細菌染色體間移動并且通過這些可移動元件在同種和不同種菌屬間傳播成為了目前大腸埃希菌廣泛耐藥的重要原因。目前細菌抗生素耐藥和多重耐藥已成為全球關注的問題。大腸埃希菌(Escherichia coli，E.coli)，是存在于人和動物腸道中的正常菌群，也是引起臨床感染最常見和最重要的革蘭氏陰性桿菌之一，從上個世紀70年代報道其出現抗藥性至今，大腸埃希菌的耐藥狀況日益嚴峻。人們在對于耐藥機制的研究中發現，整合子是一種與耐藥基因水平轉移密切相關的克隆表達載體，是耐藥基因儲存和轉移的重要結構。1991年Hall等人正式提出了基因盒整合子(Gene cassette)系統的概念。基因盒整合子系統是一種具有位點特異性重組功能的可移動元件，由兩個保守區及其間的基因盒構成，在事例酶的催化下可捕獲和表達外源基因，并通過接合性質粒、轉座子、整合型噬菌體或細菌染色體在同種和不同種菌屬間傳播，使細菌耐藥性廣泛播散，是細菌多重耐藥快速發展的重要原因。

1 基因盒整合子系統

基因盒整合子系統由5保守末端(5CS)、3保守末端(3CS)和中間的可變區組成，系水平基因傳遞系統(horizontal gene transfer，HGT)。5CS包括1個整合酶基因(int I)、1個附著位點attI和啟動子;3CS結構因整合子的類型不同而異;可變區可有數量和功能不同的基因盒。基因盒是較小的可移動基因元件，常以環狀形式獨立存在，也可被整合到整合子中的DNA單元。基因盒的基本結構是由一個單基因和一個位于其下游的短的回文序列attC組成。多個基因盒可插入到同一個整合子上，為細菌產生多重耐藥性提供了可能。

1.1 整合子介導的基因水平轉移

基因盒整合子系統能夠使細菌從環境中獲取適應環境變化所需基因的同時去除掉那些會造成自身代謝冗余的基因，進而達到基因組的最優化配置，細菌對抗生素產生抗性也是適應環境的一種表現。整合子可整合數量不等且互不相同的耐藥基因，一旦細菌對某種抗生素產生耐藥基因，該耐藥基因就可能被整合子捕獲，繼而使耐藥性得以散播。整合子的水平轉移可解釋耐藥基因的擴散和多重耐藥菌株的產生。

當耐藥基因成為可移動基因盒的一部分時，可通過事例酶單個基因盒的移動、含重置基因盒、大轉座子的擴散、不同菌種間含整合子的接合質粒的移動等機制進行水平轉移，大大增強耐藥基因的擴散[1]。不同菌株的相同整合子可位于不同的DNA元件上，或者在整合子的外延序列中存在一些差異，使其有更高的移動性。接合是基因水平傳遞最常見的方式，耐藥基因的水平傳播主要是依靠接合性質粒，在接合過程中整合子可發生基因盒的捕獲或丟失。通過接合水平轉移的整合子可引起人類與動物之間大腸埃希菌對抗菌藥物抗性的播散[2]。

基因和基因組學研究表明，基因水平轉移在增加菌種的遺傳多樣性、獲得新的生物學性狀及新的微生物種的形成及其基因組的進化過程中具有非常重要的作用[3]。另外，通過質粒、噬菌體或整合子的基因水平轉移可推進微生物間的協同合作[4]。在細菌耐藥機制的研究中發現，基因盒整合子系統與細菌基因組的進化有著密切的聯系。

1.2 整合子的分類及常見耐藥基因

目前在130多種耐藥基因盒已被確認[5]，其中的基因主要為耐藥基因，編碼對多種抗菌藥物、消毒劑及防腐劑等的耐藥性。整合子根據其編碼整合酶的DNA序列不同可分為9類[6]，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類與細菌耐藥基因傳播密切相關。在大腸埃希菌的研究中目前發現了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類整合子，其中以Ⅰ類整合子最為常見[7]。

細菌攜帶基因盒與其耐藥表型有較好的對應關系，說明整合子介導了細菌相應的耐藥性。在季胺類化合物(qac)基因家庭中，qacE△1是qacE的缺失型[8]，3CS qacE△1sul1基因擴增結果可作為Ⅰ類整合子陽性株的檢出方法[9]。qac家庭表達細菌多種化合物外排泵，包括：季胺類、雙胍類及堿性染料。

sul1、sul2或sul3基因可介導磺胺類藥物耐藥[10]。有研究報道表明，在醫院血培養分離的135株大腸埃希菌中，幾乎一半的菌株含有整合子和sul基因，并且sul基因在不同的結構中被檢測出，對抗生素抗性的傳播起決定性作用[11]。

二氫葉酸還原酶(dhfr)基因家庭中多以基因盒插入Ⅰ、Ⅱ整合子，尤其以高頻插入到含sul1的Ⅰ類整合子中，傳遞對甲氧芐啶嘧啶類(TMP)的耐藥性。Seputiené V等人對采集于臨床患者、健康動物及患病動物不同部位的共456株大腸埃希菌對甲氧芐啶類耐藥情況及drf基因流行分布進行研究，結果顯示在Ⅰ類或Ⅱ類整合子里dfr基因在基因盒中攜帶率達73%以上[12]。

編碼β內酰胺類抗生素的基因字類繁多，bla(VIM)基因作為位于一種180kb接合質粒上Ⅰ類整合子的一部分，編碼金屬β內酰胺酶，最近發現了一種VIM4樣的名為VIM19酶，能水解青霉素類、頭孢菌素類及碳青霉烯類藥物，且具有高于VIM1對青霉素的催化效率[13]。另外有研究指出，攜帶有bla(CTXM14)和bla(CTXM15)的大腸埃希菌有可能獲得對碳青霉烯類藥物的耐藥[14]。

aad編碼氨基糖苷腺苷基轉移酶，介導對氨基糖苷類耐藥：aac編碼氨基糖苷類乙酰基轉移酶，aac(6′)ibcr與產ESBLs大腸埃希菌高水平對喹諾酮和氨基糖苷類耐藥有重要的關系[15]。

2 整合子介導的大腸埃希菌耐藥

以往常用大腸埃希菌天然耐藥機制中的基因突變和耐藥性質粒介導細菌耐藥性來解釋多重耐藥[16]，但對于沒有接觸過抗生素的病原菌也會出現抗生素耐藥的這種情況，可用基因盒整合子系統來解釋。大腸埃希菌通過該系統，在整合酶的作用下，不斷地從周圍環境捕獲耐藥基因，通過啟動子作用得以表達，使細菌具有耐藥性或多重耐藥性[17]。致病菌和非致病菌在人類與動物之間共存，耐藥基因可通過可移動遺傳元件相互傳遞，甚至擴散到整個生態系統。

2.1 健康人糞便中大腸埃希菌的耐藥

大腸埃希菌作為人體固有菌群得以長期存在，是其耐藥株的最大儲存庫，臨床感染的大腸埃希菌多來源于腸道，由于人可不斷排出其耐藥株，通過污染周圍環境在人與畜、人與人之間傳播，因此研究和監測其在健康人群的耐藥狀況對臨床致病菌的控制和細菌耐藥性的傳播有著重要作用和意義。大多數學者認為出現多重耐藥的主要原因是抗菌藥物的廣泛應用和不合理應用，除了抗菌藥物與細菌耐藥的研究外，也有研究是否與人類日常生活中密切接觸有關的相關性問題。目前已有不少關于健康人腸道大腸埃希菌攜帶整合子及健康人可作為很多抗菌藥物耐藥基因儲藏庫[18]的報道，甚至在農業、家禽養殖業等生態領域均出現了整合子的身影。另外，耐藥基因可通過非致病性大腸埃希菌與沙門菌[19]等致病菌高效交換其耐藥基因，從而獲得相應的耐藥性。Ho PL等人對來自可食性動物和人的糞便、泌尿道感染病人的174株大腸埃希菌進行研究發現，動物糞便株中Ⅰ類整合子的攜帶率較另外兩種來源的菌株高[20]。因此推測，健康人群大腸埃希菌的這些耐藥基因可能是通過整合子由可食性動物中的細菌而獲得的。

2.2 可食性動物中大腸埃希菌的耐藥

由于抗生素對動物生長的促進作用，多種抗生素常添加于動物飼料中，小劑量、長時間接觸誘導細菌耐藥性產生[21]。耐藥基因可從動物源細菌通過食物鏈轉移給人，這樣耐藥基因和源于正常人體內的耐藥菌株在腸道正常菌群中積聚，糞便中含有整合子的耐藥菌排入環境中，導致自然界耐藥菌大量增加。因此，食物鏈對細菌耐藥性的產生和傳播是一個不可忽視的環節。大腸埃希菌的耐藥基因可以通過整合子，尤其是Ⅰ類整合子，在動物和人類之間水平轉移，進一步加快和擴大細菌抗藥性的播散。

有研究對采集于不同超市的79株來自可食性動物樣本中大腸埃希菌進行分析顯示，食物樣本可作為編碼ESBLs基因和可能通過食物鏈將整合子傳遞給人的貯存庫[22]。Ⅰ型整合子及其基因盒的存在與否明顯影響著大腸埃希菌的耐藥性和多重耐藥率、耐藥譜，是在基因水平監測多重耐藥性的重要指標，同時也為獸醫更好的應用抗菌藥物[23]以及臨床科學防治提供了依據。也有研究發現，自然環境中的有些菌株在做整合子檢測時同樣獲得了陽性信號并且所攜帶的基因盒無明顯差異，而自然環境中抗生素壓力并不明顯存在，說明耐藥基因的傳遞不僅僅依整于選擇壓力，可能與食物鏈有著密切關系。目前，食物鏈中的大腸埃希菌耐藥及多重耐藥菌株都非常普遍。

2.3 臨床產ESBLs大腸埃希菌的耐藥

超廣譜β內酰胺酶(extended spectrum βlactamases，ESBLs)是由細菌質粒介導的能水解甲氧亞氨基β內酰胺抗生素并可被β內酰胺酶抑制劑(如克拉維酸)所抑制的一類β內酰胺酶。ESBLs屬于Ambler分子分類法中的A類、Bush功能分類法中的第二群2be亞類。按照編碼基因的同源性，將ESBLs分為TEM型、SHV型、OXA型、CTMM型和其它型。ESBLs主要產生于大腸埃希菌和克雷伯菌屬，編碼ESBLs的絕大多數基因在質粒上，極少位于染色本上，質粒介導的產ESBLs是導致革蘭陰性菌對β菌酰胺酶抗菌藥物耐藥的重要機制。整合子是細菌基因組中保守的、自我位移有缺陷[24]，常通過接合性質粒等元件作為共同的移動工具。整合子的分布可借助于轉化、轉導及接合等方式在同種屬甚至不同種屬細菌的不同元件間不斷轉移，導致更多的細菌產生ESBLs，并通過整合和重組使多種耐藥基因群聚產生多重耐藥。細菌整合子的攜帶與多重耐藥性高度一致，而不同耐藥質粒的整事子插入區可攜帶相同的耐藥基因盒，也間接反映了整合子耐藥基因盒的頻繁流動性及抗菌藥物選擇壓力下所產生的耐壓性積聚現象。另外，β內酰胺類藥物可促使ESBLs基因拷貝數增加而導致細菌高產ESBLs。

有研究表明，產ESBLs菌株隨整合子的有無表現出對β內酰胺類耐藥的差異，可能與整合子陽性株中存在某些水解能力更強的ESBLs型別有關。產ESBLs菌株中blaSHV、blaCTX、blaTEM基因與整合子相關性的研究發現，整合子在3種ESBLs基因中的陽性比例接近，但經質粒與整合子共同轉移的頻率中blaCTX的最高，提示blaCTX和整合子位于同一轉移單位元件上[25]。另外，含有整合子的產ESBLs菌株在播散過程中，除了β內酰胺類抗菌藥物所起到的篩選作用外，整合子上其它耐藥基因所對應的抗菌藥物也會起到篩選ESBLs基因的作用，在醫院內多樣的抗菌藥物壓力下，ESBLs的播散速度和范圍會大大增加。2002年，Hanson等從1株沙門菌攜帶的質粒上同時發現了ESBLs和AmpC基因，被命名為產超超廣譜β內酰胺酶(ESACs)菌株，已經成功將ESBLs和AmpC酶拼命起來共同應對抗菌藥物的攻擊;最近，在澳大利亞第一次發現了攜帶有blaNDM1基因并且表達CTXM15的多重耐藥大腸埃希菌[26]，可見細菌的耐藥性越來越強。

有些抗生素在臨床治療中應用較少或已被停用，整合子攜帶的編碼其抗性的基因盒雖有可能被整合酶剪切下來，但并不一定會丟失。當細菌被再次暴露于這些抗生素環境中，整合子能通過遺傳記憶的方式，利用啟動子附近的整合酶將基因盒區域3′端的基因盒重新配置，恢復對抗生素的抗性。

3 結 語

大腸埃希菌耐藥狀況已經十分普遍，目前在臨床患者、健康人、可食性動物甚至是農業、家禽養殖業等多個領域均有涉及。基因盒整合子系統成為多種細菌耐藥機制的研究重點[27]，同時為耐藥基因水平轉移及多重耐藥性的快速播散提供了條件。對于如何降低或阻斷整合子捕獲耐藥基因和耐藥基因的水平轉移過程，進而控制細菌耐藥性及多重耐藥性的傳播還需進一步的研究和探討，從而能更好地指導合理應用抗菌藥物，減少藥物選擇壓力的產生，為新抗生素的研究創造條件。