【摘要】 目的: 為獲得大腸癌的特異性抗原基因， 構建人大腸癌抗原基因的 cDNA噬菌體表達文庫。方法: 從2株人大腸癌細胞CCL187和CX1中提取總RNA， 分離純化mRNA， 并以此為模板合成第1 鏈 cDNA， 用置換法合成第2 鏈 cDNA。雙鏈 cDNA 經末端削平、 EcoRⅠ接頭連接、 XhoⅠ 酶切、 過柱分級分離， 除去<400 bp 片段。收集符合需要的cDNA片段與噬菌體ZAP Express載體連接， 體外包裝后獲得人大腸癌抗原基因的cDNA噬菌體表達文庫。結果: 構建的人大腸癌抗原基因的cDNA噬菌體文庫， 原始庫容量為2.3×109 pfu/L， 重組率97%。重組子插入cDNA片段平均大小1 kb以上。結論: 成功地構建高質量的人大腸癌抗原基因的cDNA噬菌體表達文庫， 為大腸癌的特異性抗原篩選奠定了基礎。

【關鍵詞】 人大腸癌; 噬菌體; cDNA表達文庫

［Abstract］ AIM: To construct a cDNA phage expression library of colorectal carcinoma antigens for screening colorectal carcinoma specificantigens. METHODS: The total RNA was extracted from two colorectal carcinoma cell lines CCL187 and CX1 . The mRNA from total RNA was isolated to synthesize the first and second strand cDNA. The dscDNA termini were blunted with pfu DNA polymerase. The blunted cDNAs were ligated with EcoRⅠadapters and then digested by XhoⅠ. Small cDNA molecules（<400 bp）were removed through size fraction. After the cDNAs were inserted into ZAP expression vector， the ligated products were packaged in vitro and the bacteriophage particles infected the host strains XL1Blue MRF′. RESULTS: The efficiency of the primary was 2.3×109 pfu/L， while the recombination rate reached to 97%. The average length of the inserted fragment was over 1 kb. CONCLUSION: The quality of colorectal carcinoma cDNA phage expression library is excellent and helpful to screen colorectal carcinoma specificantigens. ［Keywords］colorectal carcinoma; bacteriophage; cDNA expression library

大腸癌是消化系統的常見惡性腫瘤之一， 死亡率有逐年上升的趨勢。因此早期診斷和治療是提高大腸癌治愈率的關鍵［1］。我們已成功制備了以人大腸癌細胞系CCL187為免疫源的鼠抗人大腸癌單克隆抗體(mAb) ND1［2］， 進一步篩選和鑒定ND1 mAb所識別的特異性大腸癌抗原， 可為大腸癌早期診斷和免疫治療提供新的靶點。而尋找抗原基因的最有效方法是構建cDNA文庫 ， 繼而進行篩選、 克隆。國內外已開展大腸癌cDNA文庫構建和大腸癌相關腫瘤抗原篩選方面的研究［3， 4］。本實驗中用2株人大腸癌細胞系CCL187和CX1作為構建文庫的材料來源， 以λ ZAP Express為載體， 構建了人大腸癌抗原基因的cDNA噬菌體表達文庫。

1 材料和方法

1.1 材料 CCL187和CX1人大腸癌細胞株由美國哈佛大學醫學院腫瘤所惠贈。TRIzol試劑購自美國Invitrogen 公司; DMEM培養基購自Gibco公司; mRNA分離純化試劑盒購自德國Qiagen公司; ZAP Express cDNA Synthesis Kit和ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 購自美國Stratagene 公司。LB 培養基胰蛋白凍、 酵母提取物購自 Oxoid LTD; 鹽酸四環素購自 Amresco 公司; 異丙基硫代βD半乳糖苷 (IPTG) 、 5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷( Xgal)為TaKaRa公司產品。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和純化 培養人大腸癌細胞CCL187和CX1至對數生長期， 倒去培養液， 用PBS沖洗后加入TRIzol試劑， 裂解細胞并抽提總RNA， 用Qiagen的mRNA分離純化試劑盒分離純化mRNA， 用紫外分光光度計測定其A260/A280比值及含量， 用MOPS甲醛變性凝膠電泳觀察完整性。

1.2.2 cDNA 合成 按Stratagene公司試劑盒說明書進行。取5 μg 純化的mRNA樣品作為模板， 用50個堿基的寡聚核苷酸為合成引物， 序列為5′GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA ACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3′（下劃線處為Xho I 酶切位點）， 加逆轉錄酶StrataScriptRT（MMLV）， 混勻后42℃水浴1 h， 逆轉錄合成 cDNA第1鏈。置換法用RNaseH將mRNA降解成小片段作為引物合成 cDNA 第2鏈。合成的 cDNA第1鏈取5 μL， 第2鏈取1 μL用于電泳觀察片段大小。雙鏈合成后經 Pfu DNA聚合酶將鏈末端補平， 末端補平的cDNA上下游與EcoRⅠ適配子接頭連接， 再將EcoRⅠ適配子的5′末端磷酸化， 用XhoⅠ酶切消化， 生成的cDNA分子一端帶有Xho I黏性末端， 另一端帶有EcoR I黏性末端。此cDNA產物經Sepharose CL2B層析柱按分子大小分離并分部收集， 共收集15管， 分別合并第6、 7、 8管和第9、 10、 11管， 合并后的兩管各取8 μL經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳觀察cDNA 產物片段大小。收集大于400 bp的片段并混勻， 乙醇共沉淀后溶于3.5 μL去離子水中， 取2.5 μL (100 ng) 的cDNA在T4 DNA連接酶的作用下與1 μg的ZAP Express載體進行連接， 載體預先用EcoRⅠ和XhoⅠ處理過。按Stratagene 公司包裝試劑盒說明進行包裝反應: 從-80℃取出包裝蛋白， 融化后加入連接產物， 22℃水浴 2 h。反應結束加入500 μL噬菌體稀釋液和 20 μL氯仿， 混勻離心， 上層液即為 cDNA 原始文庫， 4℃保存。取1 μL原庫液做梯度稀釋， 與200 μL的 XL1Blue MRF′菌株混合， 鋪板， 計數藍白色斑， 測定文庫滴度及重組率。

1.2.3 cDNA 文庫的擴增及質量鑒定 按每個150 mm平板生長5×104個克隆數計算， 取適量原始文庫液與 XL1Blue MRF′菌株混合， 鋪板。37℃孵育， 噬斑長至約1～ 2 mm， 給每個平板內加入10 mL SM 液， 4℃過夜。再放置搖床緩慢搖動1 h， 以洗脫噬菌體。收集洗脫液， 加入終濃度為50 mL/L的氯仿， 混勻， 離心取上清， 即為cDNA擴增文庫。加入終濃度為3 mL/L的氯仿和70 mL/L的二甲基亞砜（DMSO）， -80℃保存。取1 μL擴增文庫按梯度稀釋， 鋪板， 測定擴增文庫滴度。同時， 隨機挑取8個白色噬菌斑， 分別置于 20 μL SM 液中4℃過夜。各吸取1 μL 進行PCR反應， 以擴增插入片段。在50 μL反應體系中加入滅菌去離子水37 μL， 10×Advantage2PCRbuffer 5 μL， dNTP mix 2.0 μL， T3、 T7 引物各2 μL， Taq DNA 聚合酶1 μL。PCR反應參數: 94℃預變性1 min， 94℃ 30 s， 51℃ 30 s， 72℃ 4 min， 30個循環， 72℃ 10 min。取5 μL擴增產物以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析， 鑒定插入的 cDNA 片段大小。

2 結果

2.1 總RNA的提取和mRNA的分離純化 總RNA經紫外分光光度計測A260/A280為1.87， 經MOPS甲醛變性凝膠電泳觀察， 28 S和18 S條帶清晰， 亮度比例恰當， 說明總 RNA 未被降解(圖1)。mRNA紫外分光光度計測A260/A280為2.02， 表明mRNA純度高， 符合構建文庫要求。

圖1 人大腸癌細胞系CCL187和CX1細胞總RNA（略）

Fig 1 Electrophoresis result of colorectal cancer cell lines CCL187 and CX1 total RNA

M: DL 2 000 marker; 1: Total RNA.

2.2 cDNA第 1、 2 鏈的合成及鑒定 合成的 cDNA第1、 2鏈瓊脂糖凝膠電泳結果表明， cDNA的第 1 鏈片段集中區在1.0～2.0 kb之間; 第2鏈與第1鏈相似 ， 為連續拖影smear， 大小分布均勻， 符合實驗要求（圖2）。 將所合成的cDNA通過SepharoseCL2B柱層析分離， 分步收集后， 分別合并第 6、 7、 8管和第9、 10、 11管， 并取小量體積電泳 (圖3)， 結果顯示， 在所收集的第6、 7、 8管中的cDNA大小在500 bp以上， 符合 cDNA文庫構建的要求。

圖2 cDNA第1鏈和第2鏈合成情況的電泳分析（略）

Fig 2 Electrophoresis analysis of firststrand and secondstrand of cDNA

M: DL 2 000 marker; 1: Firststrand cDNA; 2: Secondstrand cDNA.

圖3 過柱分離所收集cDNA 樣品的電泳分析（略）

Fig 3 Electrophoresis analysis of collected cDNA samples after column chromatograph

M: DL 2 000 marker; 1: Collected cDNA fractions (6-8 tubes); 2: Collected cDNA fractions (9-11 tubes).

2.3 cDNA表達文庫的鑒定 經測定原始文庫容量為2.3 ×109 pfu/L。在涂有 Xgal、 IPTG 的平板上進行藍/白斑篩選， 測定文庫重組率約為97%。原始文庫經擴增后， 測定滴度為1.2×1012 pfu/L。

2.4 cDNA表達文庫插入片段的PCR分析 隨機挑取8個克隆經PCR鑒定cDNA插入片段大小。10 g/L瓊脂糖電泳結果顯示， 插入片段長度平均達1.0 kb 以上 (圖4）。

圖4 PCR擴增cDNA表達文庫插入片段（略）

Fig 4 PCR amplification of inserted fragments of cDNA library

M: DL 2 000 marker; 1-8: The PCR products of the clones picked randomly from the cDNA library.

3 討論 cDNA文庫的質量主要反映在文庫的代表性和重組cDNA片段的序列完整性兩個方面。文庫的代表性可用庫容量來衡量。根據以往文獻報道用抗體或血清篩選cDNA文庫， 所構建的cDNA文庫至少需含106以上的重組子， 重組率>90%。我們選取2株人大腸癌細胞建庫， 有著相對單一的轉錄本庫， 比新鮮腫瘤標本更具有代表性。構建的人大腸癌抗原基因的cDNA噬菌體表達文庫原始文庫容量為2.3×109 pfu/L， 重組率約為97%， 完全達到這一標準。 本研究選用的 Stratagene公司試劑盒在合成cDNA第1鏈時， 所用的反轉錄酶StrataScript RT是由鼠源反轉錄酶(MMLVRT)經基因工程改造而來， 無RNaseH活性。它較未改造的酶在合成cDNA第1鏈時產量更高， 全長cDNA的比例也顯著增加。在 cDNA第 2鏈合成的過程中采用的是置換合成法， 利用RNaseH在雜交鏈的mRNA鏈上造成缺口， 從而產生一系列RNA引物， 使之成為合成第2鏈的引物， 在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第 2鏈。這一做法的優點是可以使第1鏈 的反應產物不須進一步處理或純化就可直接用于第2鏈的合成。而且不需要使用 核酸酶切割雙鏈S1 cDNA的單鏈發卡環。另外也避免了在 PCR擴增過程中因擴增效率的不同所帶來的 mRNA原始豐度的變化， 這對于一些較低拷貝數基因的克隆具有優勢， 也是我們選擇該方法的主要原因。本研究所選用的噬菌體 ZAP Express 載體， 是一個插入型載體， 既可在真核細胞表達， 又可在原核細胞表達; 在其質粒序列內有一多克隆位點， 進入宿主菌后其質粒部分可從載體上切下， 形成質粒載體。這個質粒載體多克隆位點兩側有T7和T3啟動子， 有利于DNA序列分析， RNA 序列分析和 RNA 探針合成。該載體攜帶著存在于編碼β半乳糖苷α互補片段的lacZ基因區域內的多克隆位點， 長至10 kb的 cDNA 都可以插入 lacZ 啟動子下游的多克隆位點內。目的基因可定向插入位于載體多克隆位點內的EcoRⅠ和 XhoⅠ內切酶位點之間。 重組子插入片段的大小也是評價文庫質量的重要標準。插入片段的大小與條件有關， 片段太短則文庫質量不高。另外， lacZ 基因突變也可產生非重組的白色噬菌斑。因此我們隨機挑取8個白斑， 經PCR反應直接分離插入的cDNA。結果顯示， 所有白斑均有插入片段， 大小0.5 kb～3.0 kb， 平均超過1.0 kb， 完全符合質量要求。 體內外一系列實驗顯示， ND1 mAb特異性強， 親和力高， 并優于目前廣泛采用的美國商業產品抗cEA mAb［5］。因此， 成功構建人大腸癌抗原基因的 cDNA噬菌體表達文庫為尋找特異性抗原， 并為應用于臨床大腸癌早期診斷及治療奠定了基礎。