家蠶AGO2蛋白的單克隆抗體制備
摘要：Argonaute（AGO）蛋白家族在小RNA誘導的基因沉默中發揮重要作用。基于家蠶基因組測序發現的AGO蛋白編碼序列,選擇Bm AGO2為目標蛋白質,制備該蛋白質的單克隆抗體,為進一步研究其介導的miRNA靶基因以及基因調控網絡奠定試驗基礎。通過分析Bm AGO2蛋白的抗原性分布,篩選出Bm AGO2抗原表位區aAGO2,設計引物擴增目的片段,構建重組表達載體p ColdⅡ-aAGO2原核表達aAGO2蛋白,以純化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠。剖取免疫小鼠脾臟,將脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0融合。以HAT選擇培養基及間接ELISA法篩選陽性克隆,經Western blotting和免疫沉淀檢測,獲得2株生長狀態好、能分泌高效價抗體的單克隆雜交瘤細胞株I5-A9和E1-3。經抗體亞型檢測后,選擇細胞株I5-A9進行大量培養,菌液注射小鼠腹腔制備的腹水經辛酸-硫酸銨沉淀及Protein A/G親和層析純化,獲得了純度較高的Bm AGO2單克隆抗體。利用獲得的抗體免疫共沉淀家蠶卵巢培養細胞Bm N以及家蠶5齡幼蟲的內源Bm AGO2蛋白,從分離的結合RNA檢測到小RNA被顯著富集,表明成功制備了可用于免疫共沉淀的Bm AGO2單克隆抗體并分離BmAGO2結合的RNA。
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