Gibson組裝技術簡化腺病毒載體反向遺傳改造
摘要：重組腺病毒是常用的基因轉移載體,本文介紹一種對腺病毒基因組進行反向遺傳改造的策略。擬在維持基因編碼蛋白氨基酸序列不變的前提下,突變去除重組人5型腺病毒Ad5GFP基因組的PmeI酶切位點。軟件分析腺病毒質粒pAd5GFP序列,選擇限制性內切酶BamHI將pAd5GFP切割為大小11.7和24.6kb兩個片段,24.6kb大片段自身環化形成一個質粒pAd5GB,PmeI位于其上。PmeI/AscI雙酶切pAd5GB質粒,產生2.4kb和22.2kb兩個片段;在引物部位引入突變的PmeI位點(由gtttaaac突變為gtttaaaT),PCR擴增得到兩端各延長30bp的上述2.4kb片段,與22.2kb片段進行Gibson組裝,轉化E.coli TOP10感受態細胞,得到pAd5GBXP質粒。BamHI酶切pAd5GBXP,堿性磷酸酶處理,與11.7kb片段連接,還原得到腺病毒質粒pAd5GXP。PacI線性化pAd5GXP質粒,轉染293細胞,拯救得到Ad5GXP病毒;酶切分析證明Ad5GXP基因組不含有PmeI位點。研究結果說明將酶切連接與DNA組裝技術相結合,能夠方便靈活地對腺病毒基因組進行突變改造。
注: 保護知識產權,如需閱讀全文請聯系病毒學報雜志社
相關推薦
更多
