【摘要】 目的： 使用超順磁性氧化鐵納米粒子（SPIO）對(duì)成肌細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記，探討SPIO標(biāo)記方法及SPIO對(duì)細(xì)胞的影響. 方法： 常規(guī)方法進(jìn)行成肌細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用脂質(zhì)體包被的SPIO標(biāo)記成肌細(xì)胞，用光鏡及電鏡觀察標(biāo)記效率及對(duì)細(xì)胞增殖的影響，臺(tái)盼藍(lán)染色及JC1觀測(cè)SPIO對(duì)細(xì)胞活力的影響. 結(jié)果： 普魯士藍(lán)染色證實(shí)了每個(gè)標(biāo)記細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有多少不等的藍(lán)染鐵顆粒，單純SPIO標(biāo)記有效率為50%，脂質(zhì)體包被的SPIO標(biāo)記有效率為100%，電鏡也觀測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的SPIO顆粒. SPIO標(biāo)記對(duì)細(xì)胞無毒性，不影響細(xì)胞的增殖及活性. 結(jié)論： 脂質(zhì)體包被SPIO標(biāo)記成肌細(xì)胞方法簡(jiǎn)單、高效、無毒，可用于磁共振對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行活體內(nèi)外無創(chuàng)動(dòng)態(tài)示蹤研究. 【關(guān)鍵詞】 成肌細(xì)胞 超順磁性氧化鐵 磁共振成像 0引言 生物治療是改善和緩解終末期缺血性心臟病的理想手段，其中以細(xì)胞移植最有臨床應(yīng)用前景［1］. 但需要解決一個(gè)重要問題是植入細(xì)胞的存活、遷移如何識(shí)別和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè). MR顯微成像是最近出現(xiàn)的顯微影像技術(shù)，具有較高的分辨率，能夠分辨近似于細(xì)胞大小的組織［2］，理論上能夠動(dòng)態(tài)跟蹤移植細(xì)胞. 但目標(biāo)細(xì)胞必須經(jīng)MR對(duì)比劑標(biāo)記后才能與背景組織區(qū)別而被MR檢測(cè)到. 超順磁性氧化鐵納米粒子（superparamagnetic oxide iron particle， SPIO）是一種新型磁共振對(duì)比劑，本研究我們探討SPIO標(biāo)記成肌細(xì)胞方法及其對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響，為臨床利用MRI技術(shù)無創(chuàng)監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞在心臟內(nèi)的存活和遷移奠定基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料 SD乳大鼠. DMEM培養(yǎng)基， 小牛血清(FBS)， 脂質(zhì)體2000， JC1（Molecular probes）均為美國Gibco公司產(chǎn)品. Endorem：超順磁性氧化鐵納米粒子（SPIO市售制劑，11.2 mg Fe2+/mL），由荷蘭鹿特丹Erasmus大學(xué)醫(yī)學(xué)中心放射線科張卓立博士后提供. CO2培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡及透射電鏡. 1.2方法 1.2.1成肌細(xì)胞分離培養(yǎng) 將出生3 d以內(nèi)的SD大鼠頸椎脫位法處死， 無菌條件下取雙下肢肌肉， DHanks液洗去殘血，祛除筋膜等周圍組織，用含抗生素的無血清培養(yǎng)液沖洗2次，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小肌肉碎塊， 無血清培養(yǎng)液沖 洗2次， 靜置1 min并去上層液及飄浮組織. 加5倍體積2 g/L Ⅰ型膠原酶，37℃ 水浴消化50 min， 2000 r/min離心10 min，去上清液，底層細(xì)胞和碎片用DMEM洗2次，制成骨骼肌單細(xì)胞懸液，再加5倍體積2.5 g/L胰蛋白酶，37℃ 水浴消化30 min，釋放位于骨骼肌肌膜的成肌細(xì)胞，加入150 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液8 mL阻止酶消化，2700 r/min離心10 min，去上清，重懸細(xì)胞離心去上清，反復(fù)4次，最后一次用2 mL不含F(xiàn)BS的DMEM重懸細(xì)胞，采用Percoll（細(xì)胞分離液）非連續(xù)密度梯度離心法除去成纖維細(xì)胞，將所得細(xì)胞加入150 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基中，吹勻、計(jì)數(shù)，接種于內(nèi)置處理過的蓋玻片的培養(yǎng)板中. 1.2.2脂質(zhì)體包被SPIO方法 30 μL脂質(zhì)體2000稀釋于0.5 mL OptiMEM血清培養(yǎng)基中為管1，總量含112 μg Fe2+的Endorem(SPIO)稀釋于0.5 mL OptiMEM血清培養(yǎng)基中為管2， 5 min后混合管1及管2并室溫放置20 min，獲得脂質(zhì)體包被SPIO的混懸液. 總量含112 μg Fe2+的Endorem稀釋于1 mL OptiMEM血清培養(yǎng)基，獲得單純SPIO的混懸液. 1.2.3SPIO標(biāo)記 成肌細(xì)胞提取傳代（第2代）后第2日生長(zhǎng)較活躍的成肌細(xì)胞，將單純SPIO混合液及脂質(zhì)體包被SPIO混合液分別加入含1×106成肌細(xì)胞的9 mL OptiMEM中（11.2 μg Fe2+/mL），37℃， 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)23 h，即可得標(biāo)記成肌細(xì)胞. 1.2.4SPIO標(biāo)記的檢測(cè) ① 光學(xué)顯微鏡檢測(cè)： 利用普魯氏蘭可使SPIO鐵離子染色并在普通光學(xué)顯微鏡下可以觀察到的特點(diǎn)，用普魯氏蘭對(duì)SPIO標(biāo)記的成肌細(xì)胞及脂質(zhì)體包被SPIO標(biāo)記的成肌細(xì)胞進(jìn)行染色. 具體方法為：將標(biāo)記成肌細(xì)胞移入內(nèi)置處理過的蓋玻片的六孔培養(yǎng)板中. 1 h后待細(xì)胞充分貼壁后，取出蓋玻片，DHanks液洗滌3遍，40 g/L多聚甲醛固定20 min，蒸餾水洗滌2遍，Perls反應(yīng)液（等體積200 mL/L鹽酸與100 g/L亞鐵氰化鉀新鮮配制）染色20 min，蒸餾水洗滌2遍，5 g/L伊紅復(fù)染3 min，蒸餾水洗去多余的伊紅，光學(xué)顯微鏡觀察SPIO在細(xì)胞內(nèi)的位置、標(biāo)記率，每個(gè)樣本進(jìn)行多視野計(jì)數(shù)至少500個(gè)細(xì)胞. ② 電鏡檢測(cè)：消化收集標(biāo)記移植細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后以25 mL/L戊二醛4℃固定15 min，離心（2000 r/min， 10 min）收集細(xì)胞，25 mL/L戊二醛、10 mL/L鋨酸固定. 梯度乙醇脫水、包埋，超薄切片，鈾鉛雙染，透射電鏡觀察并攝片. 1.2.5細(xì)胞分化增殖及傳代對(duì)SPIO標(biāo)記的影響 標(biāo)記細(xì)胞分別于標(biāo)記后0， 1， 4， 8 d及細(xì)胞傳代后，進(jìn)行普魯氏蘭染色，按上述方法進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢測(cè)，觀察SPIO的標(biāo)記率及含量. 1.2.6SPIO對(duì)成肌細(xì)胞的影響 ① MTT法檢測(cè)成肌細(xì)胞活力： 將消化標(biāo)記及未標(biāo)記成肌細(xì)胞懸液分別接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加完全培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，分別于0， 1， 4， 8 d取標(biāo)記及未標(biāo)記細(xì)胞各1 孔，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算存活百分率，每一時(shí)相設(shè)4個(gè)復(fù)孔，取平均值. ② JC1染色檢測(cè)線粒體膜電位：于0， 1， 4， 8 d時(shí)，SPIO標(biāo)記細(xì)胞及未標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，取單細(xì)胞懸液，用PBS調(diào)整細(xì)胞至1×109/L加入JC1，使JC1終濃度為0.5 mg/L，室溫避光10 min，離心1000 r/min， 5 min，棄上清. 用400 μL的PBS液重懸，立即通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢查，計(jì)數(shù)發(fā)綠光（死亡細(xì)胞）的細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算死亡百分比. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所測(cè)數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1SPIO標(biāo)記普魯氏蘭染色證實(shí)標(biāo)記成肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有多少不等的藍(lán)染鐵顆粒，大部分的鐵聚合物包繞在細(xì)胞核周圍（圖1A），而細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞外則未檢測(cè)到. 單獨(dú)用SPIO標(biāo)記的細(xì)胞只有大約50%的標(biāo)記率，而用陽離子脂質(zhì)體包被的SPIO可100%標(biāo)記成肌細(xì)胞(圖1B). 2.2標(biāo)記成肌細(xì)胞電鏡觀察電鏡觀察標(biāo)記成肌細(xì)胞內(nèi)可見鐵粒子，標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)膜下可見大小不一的空泡狀結(jié)構(gòu)，高密度的鐵粒子存在于空泡內(nèi)外（圖2）. 2.3細(xì)胞分化增殖及傳代對(duì)SPIO標(biāo)記的影響分別于標(biāo)記后0， 1， 4， 8 d進(jìn)行觀察，可見100%細(xì)胞內(nèi)仍有SPIO離子，但SPIO含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減少. 細(xì)胞傳代后SPIO標(biāo)記率下降，但傳代3次后普魯氏蘭染色證實(shí)細(xì)胞標(biāo)記率仍高達(dá)90%. 2.4SPIO對(duì)成肌細(xì)胞活力的影響① MTT法檢測(cè)成肌細(xì)胞活力： 在標(biāo)記后0， 1， 4， 8 d，MTT檢測(cè)SPIO對(duì)成肌細(xì)胞存活率的影響，顯示標(biāo)記及未標(biāo)記SPIO的成肌細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1). ② JC1染色檢測(cè)線粒體膜電位的改變：熒光探針JC1是一種親脂性熒光素，可自由穿過細(xì)胞膜選擇性地進(jìn)入線粒體，單體時(shí)525 nm激發(fā)出綠光，聚集時(shí)590 nm激發(fā)出紅光，但是線粒體去極化時(shí)，由于JC1進(jìn)入線粒體內(nèi)減少，不能形成聚集，致使紅/綠熒光強(qiáng)度的比例下降，甚至呈現(xiàn)單一的綠色. 紅綠光比值是反映細(xì)胞毒性及活性的重要指標(biāo). 本實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，在各時(shí)點(diǎn)標(biāo)記細(xì)胞及未標(biāo)記細(xì)胞的表面大多呈均勻的紅色熒光，顯示綠色熒光的細(xì)胞均較少，兩組細(xì)胞在各時(shí)點(diǎn)發(fā)綠色熒光細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）. 表1SPIO 對(duì)成肌細(xì)胞活力的影響(略) 3討論 各種原因心臟病所致心肌損傷的共同特點(diǎn)是具有完整舒縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量相對(duì)或絕對(duì)減少，受損心肌細(xì)胞由纖維組織瘢痕修復(fù)，未受損的心肌細(xì)胞肥大，部分失去代償功能，最終將發(fā)展成心功能衰竭，增加具有完整舒縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)目是有效治療心肌損傷的關(guān)鍵，多個(gè)研究提示干細(xì)胞移植可以改善受損心肌功能［1］. 其中成肌細(xì)胞移植是常用的方法. 但是干細(xì)胞在移植到心臟后，是否就在疾病病變部位？數(shù)量上有無變化？其增殖分化情況如何？因此，移植細(xì)胞要進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以便跟蹤其生長(zhǎng)分化狀態(tài). 要進(jìn)行監(jiān)測(cè)則細(xì)胞移植前要進(jìn)行標(biāo)記，理想的標(biāo)記物應(yīng)具備以下條件： ① 高標(biāo)記率. ② 細(xì)胞分化狀態(tài)下不能改變細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的表達(dá). ③ 細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)育過程中能維持穩(wěn)定的標(biāo)記物含量. ④ 能夠無創(chuàng)在體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè). 目前常用的標(biāo)記方法有： 3HThymidine標(biāo)記法、 β半乳糖酐酶基因（Lacz）轉(zhuǎn)染細(xì)胞標(biāo)記法、熒光標(biāo)記法等，但均不能滿足以上所述理想標(biāo)記物的要求. 這些方法雖有較高的標(biāo)記率，但最大的問題是無法在活體內(nèi)顯示標(biāo)記細(xì)胞，只能是組織學(xué)方法［3］，這些方法的評(píng)價(jià)都只能在死后的尸檢中進(jìn)行. 因此急需發(fā)展新的非侵入性的顯像方法來評(píng)價(jià)心肌對(duì)干細(xì)胞治療的反應(yīng).

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