【摘要】 目的： 使用超順磁性氧化鐵納米粒子（SPIO）對成肌細胞進行體外標記，探討SPIO標記方法及SPIO對細胞的影響. 方法： 常規方法進行成肌細胞培養，應用脂質體包被的SPIO標記成肌細胞，用光鏡及電鏡觀察標記效率及對細胞增殖的影響，臺盼藍染色及JC1觀測SPIO對細胞活力的影響. 結果： 普魯士藍染色證實了每個標記細胞胞質內有多少不等的藍染鐵顆粒，單純SPIO標記有效率為50%，脂質體包被的SPIO標記有效率為100%，電鏡也觀測到細胞內的SPIO顆粒. SPIO標記對細胞無毒性，不影響細胞的增殖及活性. 結論： 脂質體包被SPIO標記成肌細胞方法簡單、高效、無毒，可用于磁共振對標記細胞進行活體內外無創動態示蹤研究. 【關鍵詞】 成肌細胞 超順磁性氧化鐵 磁共振成像 0引言 生物治療是改善和緩解終末期缺血性心臟病的理想手段，其中以細胞移植最有臨床應用前景［1］. 但需要解決一個重要問題是植入細胞的存活、遷移如何識別和動態監測. MR顯微成像是最近出現的顯微影像技術，具有較高的分辨率，能夠分辨近似于細胞大小的組織［2］，理論上能夠動態跟蹤移植細胞. 但目標細胞必須經MR對比劑標記后才能與背景組織區別而被MR檢測到. 超順磁性氧化鐵納米粒子（superparamagnetic oxide iron particle， SPIO）是一種新型磁共振對比劑，本研究我們探討SPIO標記成肌細胞方法及其對細胞增殖分化的影響，為臨床利用MRI技術無創監測移植細胞在心臟內的存活和遷移奠定基礎. 1材料和方法 1.1材料 SD乳大鼠. DMEM培養基， 小牛血清(FBS)， 脂質體2000， JC1（Molecular probes）均為美國Gibco公司產品. Endorem：超順磁性氧化鐵納米粒子（SPIO市售制劑，11.2 mg Fe2+/mL），由荷蘭鹿特丹Erasmus大學醫學中心放射線科張卓立博士后提供. CO2培養箱、光學顯微鏡、熒光顯微鏡及透射電鏡. 1.2方法 1.2.1成肌細胞分離培養 將出生3 d以內的SD大鼠頸椎脫位法處死， 無菌條件下取雙下肢肌肉， DHanks液洗去殘血，祛除筋膜等周圍組織，用含抗生素的無血清培養液沖洗2次，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小肌肉碎塊， 無血清培養液沖 洗2次， 靜置1 min并去上層液及飄浮組織. 加5倍體積2 g/L Ⅰ型膠原酶，37℃ 水浴消化50 min， 2000 r/min離心10 min，去上清液，底層細胞和碎片用DMEM洗2次，制成骨骼肌單細胞懸液，再加5倍體積2.5 g/L胰蛋白酶，37℃ 水浴消化30 min，釋放位于骨骼肌肌膜的成肌細胞，加入150 mL/L FBS的DMEM培養液8 mL阻止酶消化，2700 r/min離心10 min，去上清，重懸細胞離心去上清，反復4次，最后一次用2 mL不含FBS的DMEM重懸細胞，采用Percoll（細胞分離液）非連續密度梯度離心法除去成纖維細胞，將所得細胞加入150 mL/L FBS的DMEM培養基中，吹勻、計數，接種于內置處理過的蓋玻片的培養板中. 1.2.2脂質體包被SPIO方法 30 μL脂質體2000稀釋于0.5 mL OptiMEM血清培養基中為管1，總量含112 μg Fe2+的Endorem(SPIO)稀釋于0.5 mL OptiMEM血清培養基中為管2， 5 min后混合管1及管2并室溫放置20 min，獲得脂質體包被SPIO的混懸液. 總量含112 μg Fe2+的Endorem稀釋于1 mL OptiMEM血清培養基，獲得單純SPIO的混懸液. 1.2.3SPIO標記 成肌細胞提取傳代（第2代）后第2日生長較活躍的成肌細胞，將單純SPIO混合液及脂質體包被SPIO混合液分別加入含1×106成肌細胞的9 mL OptiMEM中（11.2 μg Fe2+/mL），37℃， 50 mL/L CO2培養箱中共同培養23 h，即可得標記成肌細胞. 1.2.4SPIO標記的檢測 ① 光學顯微鏡檢測： 利用普魯氏蘭可使SPIO鐵離子染色并在普通光學顯微鏡下可以觀察到的特點，用普魯氏蘭對SPIO標記的成肌細胞及脂質體包被SPIO標記的成肌細胞進行染色. 具體方法為：將標記成肌細胞移入內置處理過的蓋玻片的六孔培養板中. 1 h后待細胞充分貼壁后，取出蓋玻片，DHanks液洗滌3遍，40 g/L多聚甲醛固定20 min，蒸餾水洗滌2遍，Perls反應液（等體積200 mL/L鹽酸與100 g/L亞鐵氰化鉀新鮮配制）染色20 min，蒸餾水洗滌2遍，5 g/L伊紅復染3 min，蒸餾水洗去多余的伊紅，光學顯微鏡觀察SPIO在細胞內的位置、標記率，每個樣本進行多視野計數至少500個細胞. ② 電鏡檢測：消化收集標記移植細胞，吸去培養基后以25 mL/L戊二醛4℃固定15 min，離心（2000 r/min， 10 min）收集細胞，25 mL/L戊二醛、10 mL/L鋨酸固定. 梯度乙醇脫水、包埋，超薄切片，鈾鉛雙染，透射電鏡觀察并攝片. 1.2.5細胞分化增殖及傳代對SPIO標記的影響 標記細胞分別于標記后0， 1， 4， 8 d及細胞傳代后，進行普魯氏蘭染色，按上述方法進行光學顯微鏡檢測，觀察SPIO的標記率及含量. 1.2.6SPIO對成肌細胞的影響 ① MTT法檢測成肌細胞活力： 將消化標記及未標記成肌細胞懸液分別接種于24 孔細胞培養板，加完全培養基放入培養箱進行培養，分別于0， 1， 4， 8 d取標記及未標記細胞各1 孔，經臺盼藍染色，計數細胞總數和活細胞數，計算存活百分率，每一時相設4個復孔，取平均值. ② JC1染色檢測線粒體膜電位：于0， 1， 4， 8 d時，SPIO標記細胞及未標記細胞經胰蛋白酶消化后，取單細胞懸液，用PBS調整細胞至1×109/L加入JC1，使JC1終濃度為0.5 mg/L，室溫避光10 min，離心1000 r/min， 5 min，棄上清. 用400 μL的PBS液重懸，立即通過熒光顯微鏡進行檢查，計數發綠光（死亡細胞）的細胞數及總細胞數，計算死亡百分比. 統計學處理： 所測數據采用SPSS10.0軟件進行統計學分析，計量數據以x±s表示，兩組間均數比較用t檢驗，P<0.05認為有統計學意義. 2結果 2.1SPIO標記普魯氏蘭染色證實標記成肌細胞胞質內有多少不等的藍染鐵顆粒，大部分的鐵聚合物包繞在細胞核周圍（圖1A），而細胞核內或細胞外則未檢測到. 單獨用SPIO標記的細胞只有大約50%的標記率，而用陽離子脂質體包被的SPIO可100%標記成肌細胞(圖1B). 2.2標記成肌細胞電鏡觀察電鏡觀察標記成肌細胞內可見鐵粒子，標記細胞質膜下可見大小不一的空泡狀結構，高密度的鐵粒子存在于空泡內外（圖2）. 2.3細胞分化增殖及傳代對SPIO標記的影響分別于標記后0， 1， 4， 8 d進行觀察，可見100%細胞內仍有SPIO離子，但SPIO含量隨時間的延長而減少. 細胞傳代后SPIO標記率下降，但傳代3次后普魯氏蘭染色證實細胞標記率仍高達90%. 2.4SPIO對成肌細胞活力的影響① MTT法檢測成肌細胞活力： 在標記后0， 1， 4， 8 d，MTT檢測SPIO對成肌細胞存活率的影響，顯示標記及未標記SPIO的成肌細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05，表1). ② JC1染色檢測線粒體膜電位的改變：熒光探針JC1是一種親脂性熒光素，可自由穿過細胞膜選擇性地進入線粒體，單體時525 nm激發出綠光，聚集時590 nm激發出紅光，但是線粒體去極化時，由于JC1進入線粒體內減少，不能形成聚集，致使紅/綠熒光強度的比例下降，甚至呈現單一的綠色. 紅綠光比值是反映細胞毒性及活性的重要指標. 本實驗熒光顯微鏡觀察結果表明，在各時點標記細胞及未標記細胞的表面大多呈均勻的紅色熒光，顯示綠色熒光的細胞均較少，兩組細胞在各時點發綠色熒光細胞數的差異無統計學意義（P>0.05）. 表1SPIO 對成肌細胞活力的影響(略) 3討論 各種原因心臟病所致心肌損傷的共同特點是具有完整舒縮功能的心肌細胞數量相對或絕對減少，受損心肌細胞由纖維組織瘢痕修復，未受損的心肌細胞肥大，部分失去代償功能，最終將發展成心功能衰竭，增加具有完整舒縮功能的心肌細胞數目是有效治療心肌損傷的關鍵，多個研究提示干細胞移植可以改善受損心肌功能［1］. 其中成肌細胞移植是常用的方法. 但是干細胞在移植到心臟后，是否就在疾病病變部位？數量上有無變化？其增殖分化情況如何？因此，移植細胞要進行監測，以便跟蹤其生長分化狀態. 要進行監測則細胞移植前要進行標記，理想的標記物應具備以下條件： ① 高標記率. ② 細胞分化狀態下不能改變細胞內標記物的表達. ③ 細胞在體內發育過程中能維持穩定的標記物含量. ④ 能夠無創在體動態監測. 目前常用的標記方法有： 3HThymidine標記法、 β半乳糖酐酶基因（Lacz）轉染細胞標記法、熒光標記法等，但均不能滿足以上所述理想標記物的要求. 這些方法雖有較高的標記率，但最大的問題是無法在活體內顯示標記細胞，只能是組織學方法［3］，這些方法的評價都只能在死后的尸檢中進行. 因此急需發展新的非侵入性的顯像方法來評價心肌對干細胞治療的反應.

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