【摘要】 采用滴涂法制備了Nafion/碳納米粒子復合物修飾玻碳電極，該電極對H2O2具有良好的電催化氧化性能。還利用滴涂法制備了Nafion/碳納米粒子復合物包裹的葡萄糖酶電化學生物傳感器，該生物傳感器對葡萄糖有著良好的電催化作用。應用該傳感器對葡萄糖進行了檢測，檢測線性范圍為 2.0×10－6～6.0×10－3 mol/L，檢出限為1.6×10－6 mol/L(S/N＝3)，實驗結果表明該傳感器具有良好的穩定性、重現性和抗干擾能力。對小鼠血清樣品中的葡萄糖進行檢測，結果令人滿意。

【關鍵詞】 碳納米粒子；過氧化氫；葡萄糖；電化學傳感器

Abstract The nafion/carbon nanoparticles(CNPs) composite film modified glassy carbon electrode was prepared by dropwise method，and the electrocatalyst of H2O2 at Nafion/CNPs modified electrode was investigated.The results show that electrocataytic activitie for detection of H2O2 at the modified electrode is very good.The biosensing application of CNPs was demonstrated through fabrication of an electrochemical biosensor.The biosensor was constructed by encapsulating glucose oxidase in the Nafion/CNPs composite film.The biosensor had good electrocatalytic activity toward oxidation of glucose.The glucose biosensor shows a linear range from 2.0×10－6 to 6.0×10－3 mol/L with a detection limit of 1.6×10－6 mol/L.The biosensor shows high stability，good reproducibility and can avoid the commonly coexisted interference.In addition，real rat serum samples were analyzed by this biosensor with satisfactory results.

Keywords Carbon nanoparticles； Hydrogen peroxide peroxide；Ｇlucose； Ｅlectrochemical biosensor

1 引言

在生物傳感器領域，酶電極占有重要地位[1]。但由于酶通常具有較大的分子量，其氧化還原活性中心被厚的蛋白質層包裹，酶的活性中心往往難以與電極發生直接電子轉移[2]。通過對電極進行修飾的方法可改善酶的活性中心與電極的作用，實現電子的直接傳遞[3~5]。在酶傳感器中使用納米材料，不僅可以增加酶的吸附量和穩定性，而且可以提高酶的催化活性，顯著提高酶電極的電流響應靈敏度[6，7]。碳基納米材料，由于其獨特的納米結構，既具有良好的導電性，又能保持蛋白酶的生物活性，使其在生物傳感器及生物反應系統中具有極大的應用潛力[8，9]。

碳納米粒子（CNPs）是一種新型的納米材料，可明顯促進生物分子的電子傳遞作用和生物活性的催化作用。文獻[10，11]采用Nafion分散碳納米材料，由于Nafion上富含大量的親水性磺酸基團，具有較好的水溶性，而且Nafion膜也具有較好的陽離子選擇性和生物相容性[12]，因此常被用于電極表面的修飾和安培型傳感器的構建，選用Nafion分散碳納米材料，可有效提高碳納米材料的分散性，并簡化傳感器的制作并改善傳感器的響應性能。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660B電化學工作站（上海辰華儀器公司）；JL-180型超聲波清洗儀（上海杰理科技有限公司）；電化學測量采用三電極系統：玻碳電極（Φ=3 mm）或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。葡萄糖（中國醫藥集團上海化學試劑公司），H2O2(上海化學試劑公司)，葡萄糖氧化酶（GOD，Sigma公司）； 其它試劑均為分析純；不同 pH 值磷酸鹽緩沖溶液（PBS，25 mmol/L）；實驗用水為二次石英蒸餾水；實驗在室溫下進行。

2.2 電極的處理

將玻碳電極(Φ=3 mm) 在金相砂紙上打磨，再依次在 1.0，0.3和0.05 μm 的Al2O3懸濁液上拋光成鏡面，再在無水乙醇和二次蒸餾水中分別超聲洗滌5 min，用氮氣吹干，待用。

2.3 修飾玻碳電極制備

參照文獻[13]的方法制備Nafion/碳納米粒子復合物，操作如下：將潔凈玻璃板置于燃燒蠟燭的上方，收集玻板上的蠟燭煙塵，將0.1 mg煙塵溶解于10 mL 1% Nafion乙醇溶液中，超聲90 min后，即得到 Nafion/碳納米粒子復合物。以5000 r/min離心 10 min，除去粒徑較大的產物。將 10 μL Nafion/碳納米粒子復合物滴涂于處理好的玻碳電極上，待溶劑揮發至干，即制得 Nafion/碳納米粒子復合物修飾的玻碳電極。 將葡萄糖氧化酶加入 Nafion/碳納米粒子復合物中，葡萄糖氧化酶的含量為 5 g/L，向處理好的玻碳電極上滴涂 10 μL Nafion/碳納米粒子/葡萄糖氧化酶復合物，自然干燥后，用 PBS 緩沖液沖洗，制備的酶電極放在 4 ℃的冰箱內保存備用。

2.4 測試方法

電化學實驗均在 10 mL 25 mmol/L PBS緩沖溶液（pH 7.4）中進行。實驗時，加入適量H2O2或葡萄糖溶液，采用循環伏安法和計時電流法進行測試。循環伏安實驗在靜止的電解質溶液中進行；計時安培實驗在電磁攪拌下進行。待加上操作電壓，背景電流達到穩定值后，迅速加入一定濃度的 H2O2或葡萄糖溶液到測量池中，相應的電流變化值作為響應信號。電化學測量均在室溫條件下進行。除非特別說明，所有測試的底液均通高純氮氣 20 min 除氧，并在整個實驗過程中保持氮氣氣氛。 3 結果與討論

3.1 碳納米粒子的TEM，SEM表征

圖1A為制備的碳納米粒子TEM圖像。由圖1可見，碳納米粒子表面包裹著一層Nafion膜，制備的碳納米粒子有良好的分散性，基本沒有發生團聚現象，直徑在 20~100 nm 范圍內。

圖1 Nafion/碳納米粒子復合物的透射電鏡圖（A）和碳納米粒子的掃描電鏡圖（B）（略）

Fig.1 TEM images of resulting Nafion/carbon nano-particles(CNPs)（A）and SEM images of resulting CNPs(B)

在4 ℃ 條件下，將 Nafion/碳納米粒子復合物靜置10 d仍無團聚現象出現，表明碳納米粒子在 Nafion 乙醇溶液中很穩定。

將Nafion/碳納米粒子復合物用乙醇沖洗離心后所得純凈碳納米粒子進行SEM表征 (圖1B)，凈化后的碳納米粒子呈球狀，直徑為 20~100 nm范圍內，與TEM觀察的結果相符。

3.2 Nafion /碳納米粒子復合物修飾玻碳電極對H2O2的響應

碳納米粒子具有獨特的生物相容性和電化學催化性能。圖2為 10 mmol/L H2O2在不同電極上的循環伏安圖。實驗表明，Nafion/碳納米粒子修飾玻碳電極對 H2O2的循環伏安響應明顯增強，還原峰電流顯著增高，過電位明顯降低，在裸玻碳電極上的H2O2還原電位從－0.35 V 開始，Nafion/碳納米粒子修飾玻碳電極 H2O2還原電位從－0.05 V 開始，過電位降低 300 mV。

實驗發現，Nafion/碳納米粒子膜的厚度與 H2O2的修飾量直接相關，因此考察了滴涂不同體積的Nafion/碳納米粒子對電極性能的影響。結果顯示，當Nafion/碳納米粒子體積小于10 μL時，電極對H2O2的響應電流會隨修飾體積的增大而增大； 而當修飾體積在10 ～15 μL時，電極對 H2O2的響應電流相差不大； 修飾體積大于 15 μL時，電極對 H2O2的響應電流反而減小。這可能是修飾膜較厚，從而使響應電流反而減小。因此 Nafion/碳納米粒子體積選用 10 μL。

在優化條件下進行計時安培測定，圖3為 Nafion/碳納米粒子修飾電極在－0.1 V 電位下對0.5 mmol/L H2O2的響應曲線。由圖3可見，Nafion/碳納米粒子修飾電極對加入 H2O2產生相當靈敏、快速和穩定的電流反應，電極對 H2O2的響應時間小于 5 s，表明Nafion/碳納米粒子修飾電極對H2O2具有優良的催化還原能力。測定 H2O2的線性范圍為 1.0×10－6～5.0×10－3 mol/L，傳感器檢出限為 1.0×10－6 mol/L。經過21 d后，傳感器仍能保持約 90.6%的初始響應電流值。

圖2 10 mmol/L H2O2在裸玻碳電極(a)及Nafion/碳納米粒子復合物修飾玻碳電極(b)上的循環伏安圖（略）

Fig.2 CVs of bare (a) and nafion/CNPs modified (b) GC electrode in 25 mmol/L PBS solution at pH 7.4 with 10 mmol/L H2O2vs saturated calomel electrode (SCE)

通氮氣飽和(Saturated with N2)， 掃描速度（Scan rate）50 mV/ s。

圖3 Nafion/碳納米粒子復合物修飾玻碳電極在 PBS 緩沖溶液(pH 7.4)中的H2O2的電位響應曲線（略）

Fig.3 Successive amperometric response of Nafion/CNPs film modified electrode to H2O2 in 25 mmol/L PBS(pH 7.4)

通氮氣飽和（Saturated with N2）；工作電位(Potential)：－0.1 V。 每次加入0.5 mmol/L H2O2(The H2O2 addition each time is 0.5 mmol/L as indicated).

3.3 傳感器對葡萄糖的計時電流響應

在最優實驗條件下，用計時電流法測定傳感器對葡萄糖的響應電流 (圖4)。制得的傳感器對葡萄糖具有較快的響應時間，在 4 s 內達到穩態電流 95%。在2.0×10－6 ～ 6.0×10－3 mol/L 范圍內，響應電流與葡萄糖濃度呈線性關系，相關系數為 0.9786； 檢出限為 1.6×10－6 mol/L(S/N＝3)。

3.4 傳感器的選擇性

圖5是在底液中分別加入0.1 mmol/L 葡萄糖，0.2 mmol/L 抗壞血酸，0.2 mmol/L 尿酸，0.2 mmol/L L-半胱氨酸和0.01 mmol/L 葡萄糖的計時電流響應圖。可以看到，當加入葡萄糖之后，響應電流迅速增加，并在短時間內達到平衡。而加入大濃度抗壞血酸、尿酸以及L-半胱氨酸后，響應電流值幾乎沒有發生改變。這是因為 GOD 對葡萄糖的專一性催化以及 Nafion 膜的選擇性，使制得的傳感器對葡萄糖具有良好的選擇性。

圖4 傳感器在 25 mmol/L PBS (pH 7.4) 含葡萄糖濃度5．０×10－4～6.0×10－3 mol/L的計時電流響應曲線（略）

Fig.4 Amperometric response of biosensor in 25 mmol/L PBS (pH 7.4) containing glucose from 5．０×10－4 to 6.0×10－3 mol/L

通氮氣飽和（Saturated with N2）；工作電位(Potential)：－0.1 V。 圖5 幾種干擾物質對葡萄糖測定的影響（略）

Fig.5 Effect of possible interferents in glucose biosensors

a． 0.1 mmol/L葡萄糖（Ｇlucose）；b． 0.2 mmol/L抗壞血酸（Ａscorbic acid）；c． 0.2 mmol/L尿酸（Ｕric acid）；d． 0.2 mmol/L L-半胱氨酸（L-cysteine）；e． 0.01 mmol/L葡萄糖（Ｇlucose）。

3.5 傳感器的重現性和穩定性

在葡萄糖溶液濃度為 0.1 mmol/L 時，重復測定 10 次，相對標準偏差為2.8%。實驗后將傳感器于 4 ℃下懸于PBS 溶液中保存，每隔7 d進行檢測，28 d后其響應信號為初始信號的84.6%，表明此傳感器具有較好的穩定性。這主要是因為碳納米粒子具有良好的生物相容性，所制得的Nafion/碳納米粒子復合膜能將GOD牢固地固定在電極表面，并保持其良好的生物活性。

表1 生物傳感器對小鼠血液中葡萄糖濃度測試結果（略）

Table 1 Analytic results of glucose concentration in rat serum using biosensor

3.６ 實際樣品測試

用傳感器對小鼠血清中的葡萄糖進行檢測(見表1)，回收率在98.6%～103.4%之間。結果表明，此葡萄糖傳感器的線性范圍和靈敏度令人滿意，且傳感器具有響應速度快、穩定性好、制作簡單的優點。可望用于新型葡萄糖生物傳感器的制備。