作者：劉梅，夏鑫華，侴桂新，王崢濤

【摘要】 【目的】建立丹參藥材中水溶性成分丹酚酸類和脂溶性成分丹參酮類的超高效液相(UPLC)指紋圖譜方法，為丹參的質量控制提供快速、科學的方法。【方法】以Acquity C18 BEH(21 mm×100 mm，17 μm)色譜柱，乙腈(A)體積分數04%甲酸溶液(B)梯度洗脫，90%~50%A，0~10 min;75%A，15 min。檢測波長280 nm，柱溫30℃，流速05 mL/min。【結果】在15min內得到丹參藥材水溶性和脂溶性成分的指紋圖譜，峰容量85。并采用液質連用技術(HPLCDADESI/MSn) 鑒定了其中的20個特征峰。【結論】UPLC指紋圖譜方法具有靈敏、快速、簡便、準確等特點，適合于丹參藥材及其制劑的指紋圖譜研究和質量控制。

【關鍵詞】 丹參/化學;丹酚酸類/分析;丹參酮類/分析;指紋圖譜;色譜法，超高效液相;液質連用

丹參是我國應用最廣泛的中藥品種之一，臨床上有很好的療效，以丹參作為原料藥或君藥的單一或復方制劑種類繁多。丹參藥材指紋圖譜的研究主要集中在分別研究丹參的水溶性成分和脂溶性成分指紋圖譜[1-6]，這些方法基本均是將水溶性與脂溶性成分分開，分別建立指紋圖譜。作為一種藥材中的兩大類成分，若能將兩者結合起來，在同一張譜圖上得到表征，直觀地比較其化學成分的差異，將是一項十分有益的工作。目前也有一些報道采用高效液相色譜—二極管陣列檢測器(HPLCDAD)或高效液相色譜—質譜檢測器(HPLCMS)連用的方法建立同時表征丹參藥材中水溶性與脂溶性成分的指紋圖譜，但是采用HPLC 技術，尚難以兼顧和保證兩類成分都具有良好的分離度，而且耗時較長。因此，本課題組嘗試采用快速色譜技術——超高效液相色譜(UPLC)建立丹參的指紋圖譜，現報道如下。

1材料與試劑

11實驗材料共收集了12個省、市(區)的丹參商品藥材13份(表1)。藥材經上海中醫藥大學中藥研究所吳立宏博士鑒定為唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根莖。

12儀器與試藥Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色譜儀，包括Acquity Binary Solvent Module 二元可選四溶劑高壓梯度泵，含在線真空脫氣機、Acquity Sampler Module 低擴散自動進樣器、Acquity TUV Detector高速紫外檢測器及Empower II色譜管理軟件(Milford，Boston，MA，USA)。MilliQ system超純水制備器(Millipore，Bedford，MA，USA)，KQ250DB數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，BP211D型電子天平(Satorius Co.Ltd.，德國)。甲醇、乙醇、甲酸均為分析純(上海國藥集團試劑有限公司)，乙腈為色譜純(Merck公司)，超純水為MilliQ處理水(Millipore Co.)。對照品丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA均由上海中藥標準化研究中心提供。

2方法與結果

21 色譜條件與質譜參數

211超高效液相色譜條件 Acquity C18 BEH(21 mm×100 mm，17 μm)色譜柱，乙腈(A)-體積分數04%甲酸溶液(B)梯度洗脫，90%~50%A，0～10 min;75%A，15 min。檢測波長280 nm，柱溫30℃，流速05 mL/min，進樣量2 μL，運行時間15 min。表1不同產地丹參藥材

212超高效液相色譜—質譜連用(LCMS)條件 流動相為乙腈(A)—體積分數04%甲酸溶液(B)，洗脫程序與上述條件相同。柱后分流，分流比為1∶50，進樣量10 μL，柱溫30℃，電噴霧離子源(ESI)，源電壓-32 kV，負離子模式，霧化氣(GAS1)：233 Pa，簾氣(CUR)：16 psi，去簇電勢(DP)：-20V，聚焦電勢(FP)：-80 V，去簇電勢2(DP2)：-20 V。質譜掃描質量范圍質荷比(m/z)100～800。

22樣品溶液和標準品溶液的制備

221樣品溶液的制備取丹參粉末05 g(過40目篩)，精密稱定，精密加入體積分數10%甲醇20 mL，浸泡30 min后，超聲提取30 min，放冷，3 000 r/min離心10 min，取上清液5 mL置25 mL量瓶中。殘渣加甲醇20 mL，浸泡30 min后，超聲提取60 min，放冷，3 000 r/min離心10 min，取上清液將上述25 mL量瓶補足至刻度，即得。

222標準品溶液的制備取對照品丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氫丹參酮I、丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮IIA適量，精密稱定，置同一容量瓶中，用甲醇溶解，制成含上述對照品102、126、113、106、137、118、762、100、114、122、119 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

23方法學考察

231精密度實驗取同一份供試品溶液，連續進樣5次測定，以丹酚酸B為參照峰，分別計算20個特征色譜峰的相對保留時間和相對峰面積sR值，均小于3%。說明儀器精密度良好。

232穩定性實驗取同一份供試品溶液，分別于1、3、5、7、9、12、24、48 h進樣測定，以丹酚酸B峰為參照峰，分別計算20個特征色譜峰的相對保留時間和相對峰面積sR值，均小于3%，說明樣品溶液在48 h內穩定。

233重復性實驗同一樣品粉末分別精密稱取5份，按照上述樣品制備方法制成供試品溶液，進樣檢測。以丹酚酸B峰為參照峰，分別計算色譜中20個特征色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的sR值，均小于3%。說明該方法的重復性良好。

24結果與分析

241丹參高效液相指紋圖譜主要色譜峰的LCMS鑒定以13個產地丹參藥材的共有模式作為丹參藥材的指紋圖譜(圖1)。在該指紋圖譜中，20個色譜峰被選為特征峰。通過與對照品比較相對保留時間(tR)，紫外光譜(UV)和液相色譜—質譜聯用(LCMS)質譜數據(見表2)，結合對照品和文獻[7-12]對照，確定了19個色譜峰的歸屬為1號峰丹參素，2號峰原兒茶醛，3號峰咖啡酸，4號峰丹酚酸D，5號峰丹酚酸G，6號峰丹酚酸E，7號峰丹酚酸C，9號峰迷迭香酸，10號峰紫草酸，11號峰丹酚酸B，12號峰丹酚酸A，13號峰異丹參酮IIA，14號峰羥基丹參酮IIA，15號峰丹參新醌A，16號峰丹參酮IIB，17號峰二氫丹參酮I，18號峰隱丹參酮，19號峰丹參酮I，20號峰丹參酮IIA。11號峰(丹酚酸B)既是該指紋圖譜中的最強峰，又是有效成分。故以其為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間(tR)和相對峰面積(ARP)，結果見表3。表2丹參藥材中化學成分質譜數據及鑒定表313批不同產地藥材中20個特征峰的相對峰面積值

242丹參藥材UPLC指紋圖譜分析采用上述已建立的指紋圖譜方法，對13批丹參藥材進行指紋圖譜分析，得不同產地丹參藥材指紋圖譜，結果見圖2(彩圖頁第616頁)。為了說明丹參藥材之間的差異，引入總差異率pTD(%)的概念。差異率的定義是以每個特征指紋峰與相應的標準特征指紋峰的面積歸一化值間的差與標準特征指紋峰面積歸一化值的比值來表示兩者間的差異程度，總差異率則是將每個特征指紋峰的差異率求和即得。計算公式：

pTD=ΣniAs′-Ai′As′×n

其中，pTD 為總差異率，As′為標準特征峰面積歸一化值，Ai′為待比較藥材特征峰的面積歸一化值，n為特征峰個數。以pTD代表樣品圖譜與標準圖譜之間的相似度，當pTD>1時，表明待測樣品與標準樣品之間差異較大，說明待測樣品有可能非欲鑒定品種。當pTD<1時，值越小說明待測樣品與標準樣品越相似。

在本實驗中，選取13批丹參藥材樣品的特征峰面積歸一化值的平均值作為標準特征峰面積歸一化值(表4)，結果顯示：(1)這些丹參藥材的化學成分的分布具有相似性，每批藥材被檢測的色譜峰的數目幾乎相等。(2)丹酚酸B的色譜峰占非常高的比例，最高達6313%，最低有3598%，說明該化合物是藥材中主要成分之一。(3)水溶性成分中，丹參素的含量均較低，脂溶性成分以5個色譜峰為主(平均占總脂溶性成分的80%以上)。(4)就每一個化學成分來說，藥材之間的相互差異比較大，13批藥材統計處理，所有成分的sR均在20%以上。(5) 根據pTD值來看，13個產地或收集地的丹參藥材pTD值均小于1，說明13個樣品與標準樣品之間的相似度均較高。表4不同產地13批丹參藥材指紋圖譜共有峰面積歸一化值

3討論

丹參中的兩大類化學成分極性差異較大，文獻報道顯示采用HPLC對這兩類成分進行指紋圖譜分析，通常耗費時間長而且色譜峰之間并不能達到理想的分離度，較難在一張圖譜上直觀地比較這兩種成分之間的差異[1-6]。本課題在大量實驗的基礎上優選出合適的UPLC色譜條件，建立丹參的指紋圖譜，只需運行15min就可以將丹參的水溶性與脂溶性成分在同一張色譜圖上表征，且色譜峰之間有較好的分離度，達到了高分離度兼顧快速的目的，適合于大量復雜樣品的分析。

中藥的指紋圖譜研究中，HPLC法是最常用的分析技術，但是對于一些復雜體系如中藥的指紋圖譜研究，HPLC相對來說也是一種慢速技術，由于中藥中所含化學組分多，化學差異較大，為保證目標組分的分離度，需要較長的運行時間，有時也可得到理想的色譜參數如分離度、對稱因子和容量因子等。如何在得到理想的色譜參數的情況下，盡可能地縮短分析時間是科研人員比較關注的問題。UPLC的色譜柱采用了17μm的小顆粒填料，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量，能顯著提高分離的效率從而達到縮短分析時間的目的。

本實驗中采用了UPLC技術建立丹參藥材的指紋圖譜。結果顯示，在15min中內即可獲得丹參水溶性成分和脂溶性成分的指紋信息。丹參藥材的UPLC指紋圖譜與HPLC指紋圖譜比較，色譜峰的個數、整體分布和峰形基本一致，但增加了最難分離物質對的分離度，增加了峰容量，減少了分析時間，說明UPLC比HPLC的分離能力強。

UPLC與HPLC具有相同的分離原理，因此UPLC色譜條件在HPLC條件的基礎上稍加優化即可得到理想的色譜圖結果。本實驗根據上述UPLC的色譜條件獲得了丹參藥材及其制劑的指紋圖譜，且與HPLC色譜指紋圖譜一致的結果，因此，采用UPLC 指紋圖譜方法具有靈敏、快速、簡便、準確等特點，適用于丹參藥材及其制劑的指紋圖譜研究和質量控制，值得推廣和應用。