作者：王桂龍 侯玉東 石玲波

【摘要】 目的 探索煙草浸提液對體外培養成骨細胞的附著和生長的影響。方法 將周齡SD大鼠顱蓋骨，剪成1.5 mm×1.5 mm大小組織塊，先用0.25％胰蛋白酶消化20 min、0.1％Ⅱ型膠原酶消化30 min后，再對其進行培養。倒置顯微鏡觀察細胞形態，并對其堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化能力進行鑒定。實驗分對照組和實驗組，實驗組按所加煙草浸提液濃度的不同分為0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50 g／L 7個濃度組，分別測定各實驗組細胞的生長曲線。采用SPSS13.0軟件包對數據進行雙因素方差分析。結果 煙草浸體液對成骨細胞的附著和生長起抑制作用，并隨其濃度的升高而增強。各處理組間存在顯著差異（P＜0.01）；各組內的前3 d存在顯著性差異（P＜0.01），但3.2～50 g／L組第4～7天間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 吸煙不利于口腔種植的臨床愈合。 【關鍵詞】 成骨細胞；原代培養；SD大鼠；煙草浸提液 【Abstract】 Objective To investigate the effects of smokeless tobacco extract(ST) on the attachment and growth of the rat’s osteoblasts in vitro.Methods The bone tissues from the calvaria in rats aged 1 week were cut into blocks of 1.5 mm × 1.5 mm.They were digested by 0.25％ trypsinase for 20 minutes and by 0.1％ collagenase II for 30 minutes and then the liquid supernatant was abandoned. The bone blocks were cultured to acquire isolated cells.The identification was conducted by cell morphology，histochemical staining of alkaline phosphatase (ALPase)and calcified nodules staining.The experiments were pided into control group and experiment groups.The experiment groups were pided into seven groups by the smokeless tobacco extract’s concentration: 0.8，1.6，3.2，6.4，12.5，25 and 50 g／L， then the cell growth curves were drawn. Statistical analysis was performed using SPSS13.0 software package for twoway ANOVA.Results ST inhibited attachment and growth of osteoblasts in all groups with a concentrationdependent manner. The difference among all of groups was significant（P＜0.01）; the difference between the same group was significant before 3 days（P＜0.01）， while the difference among 3.250 g／L groups was no significant after 4 days（P＞0.05）.Conclusion Smoking is harmful to the clinic healing of oral implant operation. 【Key words】 osteoblast，primary culture，rats，smokeless tobacco extract 目前，口腔種植技術因其獨特的優勢而獲得了臨床醫師及患者的青睞，而骨結合則是其成功的基礎。骨組織作為一種特殊的鈣化組織，主要由成骨細胞完成并受體內多種因素調控。隨著細胞培養技術的發展，成骨細胞的體外培養成為可能。體外培養的成骨細胞可以排除體內多種因素的相互影響，從而為骨形成和代謝機理方面的研究提供有價值的實驗依據。目前成骨細胞原代培養的方法主要有2種：酶消化法和組織塊法［1，2］。酶消化法雖可獲得大量細胞，但獲得的細胞不純。本實驗擬采用酶消化后再對組織塊進行培養的方法來獲得純度較高的成骨細胞，觀察煙草浸提液對成骨細胞的附著及生長的影響，以期證明吸煙是影響口腔種植的不利因素之一。 1 材料和方法 1.1 器材和試劑 1.1.1 主要儀器設備和材料:超凈工作臺 (蘇州集團安泰公司)；CO2培養箱 (Heraeus)；熒光倒置顯微鏡 (日本OLYMLOS)；眼科手術器械（上海手術器械廠）；血球計數板（鎮江市丹徒科達醫療用品廠）；50 ml玻璃培養瓶（Costar）；離心機（雷動爾LDZ52）；高糖DMEM（Ｇibco）；胰蛋白酶（Amresco）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；膠原酶（Invitrogen）；煙草（成品盒裝香煙，煙氣煙堿量1.2 mg，焦油量13 mg）；SD大鼠（煙臺綠葉實驗動物中心）。 1.1.2 主要試劑的配制:①含煙草浸提液培養液的配制［3］:稱取5 g成品盒裝香煙的煙絲，加入0.1 L的雙蒸水，在37℃ 孵育箱中浸泡48 h，過濾除菌，將此濃度定為50 g／L。用含15 ml／L胎牛血清的DMEM培養液配制含煙草浸提液的培養液，其濃度分別為0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50 g／L 7個濃度組。②成骨細胞礦化培養液的配制:DMEM培養基中加入雙抗(含青霉素100 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3。含礦化液的DMEM培養基中加入雙抗(含青霉素100 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3、β甘油磷酸鈉1×10-2mol/L、維生素C 50 mg/ml、地塞米松1×10-7mol/L。孵育液含3%β甘油磷酸鈉5 ml，2%巴比妥鈉5 ml，2%硝酸鈣10 ml，2%MgSO4 5 ml，蒸餾水25 ml。 1.2 實驗方法 1.2.1 大鼠成骨細胞的原代培養：周齡SD大鼠處死后用75％酒精浸泡5 min，倒置顯微鏡下取其顱頂骨，以無菌DHanks(含青霉素100 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)沖洗，刮去骨膜、剪去骨縫間結締組織，制成約1.5 mm×1.5 mm大小的碎塊，以DHanks液沖洗3次，加入0.25% 胰蛋白酶37℃下震蕩消化20 min，棄上清，0.1%的II型膠原酶消化30 min后棄上清；所得骨塊直接放入培養瓶中加入含20% 胎牛血清的DMEM 培養液，置于37℃、5% CO2 培養箱中培養。 1.2.2 細胞培養及傳代：在原代培養過程中，每3～4 d換液1次，細胞長滿瓶底時開始傳代，傳代時用差速貼壁法進行純化［4］。0.25% 胰蛋白酶37℃消化10 min左右，當觀察到細胞形態變圓，且部分細胞已開始脫離瓶底時，終止消化，離心后加入培養液進行傳代，每瓶細胞可傳代2～3瓶。傳代3～5次后，成骨細胞得到純化，用于實驗。 1.2.3 成骨細胞鑒定：①熒光倒置顯微鏡下對細胞形態的變化及生長狀況每日進行觀察。②堿性磷酸酶組織化學染色(改良Gomori鈣鈷法) 將純化后的第2代細胞接種于蓋玻片上，接種密度為1×104 /cm2。待細胞長至匯合后取出蓋玻片，以常規Gomori鈣鈷法染色。玻片無菌沖洗2次后用冷丙酮（4℃冰箱保存）固定細胞10 min，蒸餾水沖洗數次，放人孵育液中37℃孵育4～6 h，然后依次入2％硝酸鈷5 min，蒸餾水沖洗數次。1%硫化銨中浸2 min，自來水沖洗，自然晾干，甘油明膠封片。③將第4代成骨細胞接種爬片，用含礦化液的培養基培養3周，在倒置顯微鏡下可見白色結節， PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min。再用PBS沖洗2次，0.1%茜素紅TrisHCl（pH8.3）染色30 min，用PBS沖洗，晾干、封片。 1.2.4 成骨細胞生長曲線的測定：取3瓶體外培養的成骨細胞，用適量0.25%的胰蛋白酶消化10 min，離心后加入25 ml培養基，吹打成細胞懸液后，計數板計數其濃度為1.35×105/ml。取24孔培養板8塊，滴加細胞懸液入其內，每孔0.1ml，培養10 h使成骨細胞能貼壁生長，測其貼壁率。而后每塊培養板內各孔分別加入含不同濃度煙草浸提液的培養基0.9 ml，每濃度組為3孔，細胞每3 d換液一次。從加入煙草浸提液始每24 h計數1次。 1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件包對數據進行雙因素方差分析，實驗數據用 x±s表示，P＜0.01為差異有統計學意義。 2 結果 2.1 成骨細胞形態學觀察 酶消化后對組織塊繼續培養3天，倒置顯微鏡下觀察發現骨塊周圍有少量細胞長出，靠近骨塊處圓形細胞多見，遠離骨塊處體積較小的梭型細胞常見；5 d后觀察，細胞數量較多，呈梭形、三角形或不規則多邊形，分化成熟者可見有3～4個突起。傳代后細胞以梭形、三角形為主，呈集落樣生長趨勢，最終可連接成片，出現重疊生長現象（圖1）。 2.2 堿性磷酸酶（ALP）組織染色 ＡＬＰ組織染色（改良Gomori鈣鈷法）測定為陽性，顯示成骨細胞呈黑灰色著色（圖2）。 2.3 成骨細胞礦化結節茜素紅染色觀察 成骨細胞生長融合成復層后，不經傳代繼續培養，形成鈣化結節后行茜素紅染色，顯微鏡下黑色的結節染成紅色 (圖3)。

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