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利用雙重sgRNAs構(gòu)建miR-223全基因敲除小鼠

趙宣; 王曉亞; 劉莉; 劉佩娟; 辛智倩; 師長(zhǎng)宏; 張彩勤; 白冰; 黃勇; 張海 空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心; 西安710032; 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院; 陜西楊凌712100; 西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院; 西安710068

摘要：目的 利用雙重sgRNAs構(gòu)建miR-223全基因敲除小鼠。方法 針對(duì)miR-223基因設(shè)計(jì)雙重sgRNAs,將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNAs和Cas9 mRNA共同顯微注射入C57BL/6小鼠受精卵細(xì)胞。小鼠出生后取其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序以鑒定基因型,同時(shí)取小鼠肝臟研磨后提取總RNA,通過real-time PCR分析miR-223在肝臟中的表達(dá)。結(jié)果 設(shè)計(jì)了miR-223基因雙重sgRNAs并對(duì)其進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄,純化后顯微注射小鼠受精卵細(xì)胞獲得miR-223基因突變小鼠。測(cè)序結(jié)果表明突變小鼠有3種基因型,一種為6 bp的缺失突變,但未對(duì)miR-223序列產(chǎn)生影響;另外兩種為162 bp和168 bp的缺失突變,完全刪除miR-223前體和成熟區(qū)序列。與野生型相比,這兩種小鼠肝組織中幾乎不能檢測(cè)到miR-223的表達(dá)。結(jié)論 設(shè)計(jì)雙重sgRNAs并應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建miR-223全基因敲除小鼠。

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