腸道病毒EV-D68表面結構蛋白VP2、VP3的原核表達及其特異性分析
摘要：目的原核表達腸道病毒68型(enterovirus D68,EV—D68)表面結構蛋白VP2、VP3,分析其親和力和結合力,得到具備高結合力的、可結合特異性記憶性B細胞的EV-D68病毒表面結構蛋白。方法采用PCR法擴增EV-D68病毒的VP2、VP3蛋白基因,插入原核表達載體pGEX-5X-1,構建重組表達質粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,轉化到工程菌Rosetta(DE3)pLy中,異丙基硫代半乳糖苷(i-sopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導表達,表達的重組蛋白形成包涵體,經超聲洗滌、透析復性;采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel immunosorbent,SDS-PAGE)電泳、westem-blot鑒定重組蛋白;競爭性酶聯免疫吸附檢測(eIlzyme linked immunosorbent assay,EusA)檢測蛋白VP2、VP3的蛋白活性和親和力;藻紅蛋白熒光素(phycoeryth面,PE)標記VP2和VP3重組蛋白,結合CD19-APC、CD27-nTc抗體,流式細胞術檢測VP2、VP3蛋白結合特異性記憶性B細胞的情況。結果成功構建出重組表達質粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,通過雙酶切鑒定及測序分析,確認表達載體構建正確,通過表達純化,成功獲得EV-D68的VP2、VP3蛋白,SDS-PAGE電泳灰度掃描顯示,VP2蛋白的純度可達80%,VP3蛋白的純度可達75%;經westem-blot和EusA鑒定,均有抗原特異性;通過競爭EusA檢測,VP2親和力常數為2.7×10^7M^-1,為中等親和力;VP3親和力常數為3.25×10^6M^-1,為低親和力;通過流式細胞術可以檢測到病毒攻擊小鼠后脾臟細胞中的特異性記憶性B細胞。結論成功原核表達,復性純化得到EV-D68VP2、EV-D68VP3蛋白,兩個蛋白均具有較強的抗原特異性,利用流式細胞儀能檢測到特異性記憶性B細胞。最終獲得了具有較強結合能力,可用于分選抗原特異性記憶性B細胞的EV-D68表面結構蛋白VP2、VP3,為研究VP2、VP3蛋白的中和抗原表位及其廣譜中和抗體的分選檢測打下了基礎。
注: 保護知識產權,如需閱讀全文請聯系國際免疫學雜志社
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