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摘要：摘要：目的 探討沉默軸突導(dǎo)向蛋白4D（Sema4D）基因?qū)β殉舶㏒KOV3細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的影響,并驗(yàn)證Sema4D干擾RNA對人卵巢癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用.方法 針對Sema4D基因構(gòu)建短發(fā)夾RNA（shRNA）重組載體pshRNA Sema4D-A、pshRNASema4D-B和pshRNASema4D-C質(zhì)粒,并行酶切鑒定和測序分析.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法篩選RNA干擾效果最佳的重組載體,通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞（重組載體組）,并以空載體組（轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1質(zhì)粒）和未轉(zhuǎn)染組（未作任何處理）為對照.采用RT-PCR法和Westem blot法分別檢測轉(zhuǎn)染前后SKOV3細(xì)胞中Sema4D mRNA和蛋白表達(dá),并榆測轉(zhuǎn)染前后SKO3細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力.建立人卵巢癌裸鼠移植瘤模型,將滿足成瘤標(biāo)準(zhǔn)的15只裸鼠隨機(jī)分為pshRNASema4D組（重組載體組）、空載體組和未轉(zhuǎn)染組,每組5只,分別向瘤塊內(nèi)注射pshRNASema4D-B（50μg/次）、空載體（50μg/次）和磷酸鹽緩沖液（PBS,100μl/次）,每3 d注射1次,共3周,觀察移植瘤生長情況.結(jié)果 酶切鑒定和測序分析證實(shí),靶向Sema4D的3個(gè)ShRNA重組載體pshRNASema4D-A、pshRNASema4D-B和pshRNASema4D-C質(zhì)粒構(gòu)建成功.RT-PCR法篩選顯示,重組載體pshRNASema4D-B質(zhì)粒干擾效果最佳.重組載體組轉(zhuǎn)染24、48和72 h時(shí),SKOV3細(xì)胞中Sema4DmRNA的相對表達(dá)水平分別為0.401.4±0.051、0.120±0.035和0.014±0.015,重組載體組轉(zhuǎn)染72 h時(shí)的Sema4D mRNA相對表達(dá)水平明顯低于空載體組（0.521±0.019）和未轉(zhuǎn)染組（0.536±0.040,P〈0.05）.Western blot法檢測顯示,重組載體組轉(zhuǎn)染24、48和72 h時(shí),細(xì)胞中Sema4D蛋白的相對表達(dá)水平分別為0.196±0.023、0.074±0.015和0.040±0.014,重組載體組轉(zhuǎn)染72 h時(shí)的Sema4D蛋門相對表達(dá)水平明顯低于空載體組（0.275±0.009）和未轉(zhuǎn)染組（0.282±0.015,P〈0.05）.與空載體組和未轉(zhuǎn)染組比較,重組載體組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力受到抑制（P〈0.05）.注射p

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