7種豬場常見高致死病原GeXP檢測方法的建立
摘要：本研究旨在建立能同時檢測豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、壞死梭桿菌(Fn)和副豬嗜血桿菌(Hps)7種豬場常見高致死性流行病原的多重PCR檢測方法。利用7種病原體的保守序列設計7對特異性引物,同時合成了Cy-5標記的通用引物。將通用引物分別連接到特異性引物的5′端形成7對特異性嵌合引物。優化反應條件,分別使用7組嵌合引物和通用引物混合,擴增7種病原的混合cDNA/DNA,驗證其單重PCR的特異性。利用GeXP多重基因表達遺傳分析系統,混合7種嵌合引物和通用引物,擴增單一病原的cDNA/DNA,驗證其多重PCR特異性;將其他常見豬病病原的基因組作為干擾的陽性標本,利用7對混合嵌合引物和通用引物進行多重PCR分析,擴增加入了陽性標本的混合模板,驗證其多重PCR的抗干擾能力。利用重組質粒和體外轉錄的RNA進行梯度稀釋,確定GeXP多重檢測體系的靈敏度。結果表明,7種不同引物分別進行GeXP單重及多重檢測,均能檢測出特異性目的片段的信號,無明顯的干擾片段信號出現;GeXP多重檢測抗干擾試驗結果顯示,在混入3種干擾病原模板后,依然可同時特異性檢測出7種病原;GeXP多重檢測靈敏度分析顯示,在10~3拷貝/μL濃度條件下能檢測到7種不同基因的特異性結果。本研究建立的同時檢測7種豬場常見高致死性流行病原的GeXP檢測方法具有高通量、高特異性和高靈敏度的特點,為快速診斷豬流行性疾病的交叉感染和混合感染提供了新型的檢測方法。
注: 保護知識產權,如需閱讀全文請聯系中國畜牧獸醫雜志社
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