【摘要】 目的 通過對納米羥基磷灰石復合根充材料與傳統根管充填材料（充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑）進行細胞毒性、根管密合性及抑菌性的對比研究，評價納米羥基磷灰石復合材料的細胞毒性、根管壁密合度以及抑菌作用。材料與方法 細胞毒性實驗：體外培養成骨細胞，添加納米羥基磷灰石復合材料浸提液，并以培養液為陰性對照組，充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合糊劑為陽性對照組。根據ISO標準采用MTT法進行體外細胞毒實驗，測試不同浸提時間的材料浸提液與成骨細胞接觸1、3、5、7天的吸光度值，以評價其細胞毒性。根管密合性實驗：將10顆近期拔除的單根牙隨機分成2組，每組牙齒按常規方法進行根管預備。實驗組為40%納米羥基磷灰石復合糊劑充填，對照組為充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合糊劑充填。拍X線片以保證各組中實驗離體牙牙根均完善充填，充分硬固后，進行微滲漏試驗。改良葡萄糖檢測微滲漏分析裝置進行根管密合度實驗，30天后結果由葡萄糖定量分析儀測定。抑菌性實驗：將蘸有營養肉湯培養液的棉拭子反復擦感染根管，進行細菌接種、分離、鑒別、培養。培養結果為變型鏈球菌、金黃色葡萄球菌二種可利用菌種，分別用血培養基、普通培養基分別培養，對實驗組與對照組充填材料進行抑菌性實驗，觀察抑菌環大小，檢測出每組藥物的抑菌環直徑，取平均值計算。結果 細胞毒性實驗：實驗組與陰性對照組無顯著差異（P＞0.05），實驗組與陽性對照組有顯著差異（P＜0.05）。根管密合性試驗：對照組葡萄糖濃度明顯高于實驗組，有顯著性差異（P＜0.05）。抑菌性實驗：各組根充糊劑均有良好抑菌性，實驗組與對照組統計學差異不顯著（P＞0.05）。結論 納米羥基磷灰石根充材料體外細胞毒性實驗陰性，有良好的生物相容性。納米羥基磷灰石復合根充材料其與根管壁密合度方面明顯優于充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合糊劑，并具有良好的抑菌性。

【關鍵詞】 納米羥基磷灰石 根管充填 細胞毒性 微滲漏 抑菌性

根管治療術發展的總趨勢之一是研究無致癌傾向的、能夠嚴密堵塞根管的充填材料。本研究尋找一種新型的根管充填材料，有助于提高根管治療術的療效，更好地服務于口腔臨床。

1 材料和方法

1.1 實驗器材 納米羥基磷灰石，由南京愛普瑞納米材料有限公司；碘仿，哈爾濱市東北齒科材料加工廠；聚乙烯醇，國藥集團化學試劑有限公司；充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑，上海二醫張江生物材料有限公司；MTT，美國GIBCO公司；二甲基亞砜，美國GIBCO公司；胎小牛血清，美國Sigma公司；DMEM培養液，美國Gibco公司；SD大鼠，浙江大學生物實驗中心。裂鉆、根管擴大針，登士柏牙科有限公司；肉湯培養基、厭氧培養基（GAM）、需氧培養基（BA）、厭養罐、微量生化管，明新生物技術研究所；BioRADModel-550酶聯免疫酶標儀，美國Sigma公司；二氧化碳培養箱，美國熱電集團；Olympus IX-70倒置相差顯微鏡，日本OLYMPUS公司；超凈工作臺VS-1300-U，蘇州安泰空氣技術有限公司；S2309A型牙科椅，西北醫療器械（集團）有限公司；ELITYS數字X光牙片機，上海復星醫療器械有限公司；廣口瓶、粘蠟、1mol/L無菌葡萄糖溶液、2ml／瓶無菌蒸餾水裝置、改良葡萄糖滴定微滲漏儀，佳木斯大學附屬口腔醫院。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞毒性實驗

1.2.1.1 材料浸漬液的制備 采用DMEM培養液配制納米羥基磷灰石根充糊劑浸提液。稱取20納米羥基磷灰石0.5g經高壓滅菌后加入DMEM培養液10ml。振蕩混勻后在CO2細胞培養箱中37℃放置3d，3000r/min離心5min后取上清液，經濾過除菌，放入4℃冰箱保存。實驗共分3組：實驗組為20納米羥基磷灰石浸提液，DMEM培養液為陰性對照組，0.05g/ml新調制的充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑浸提液為陽性對照組。觀察成骨細胞在不同培養液中的生長繁殖情況。

1.2.1.2 實驗動物與成骨細胞培養 新生3～5d SD大鼠，體重4～6g。在無菌條件下處死，75%乙醇中浸泡5min，無菌條件下取顱頂骨，放大鏡下徹底去凈附屬組織，剪成1mm3小片，D-Hank，s液洗滌3次， 用0.25%胰蛋白酶在37℃消化30min，然后移入0.1%膠原酶溶液中，37℃下震蕩消化60min，將含細胞的消化液在1500r/min下離心2次，每次5min沉淀物用DMEM培養液制成細胞懸濁液，將細胞懸濁液按5×104/ml接種于96孔培養板加入DMEM培養液在37℃、飽和濕度，5%CO2和95%空氣孵箱內進行培養，培養液中加入含有20%胎牛血清，待培養至70%～90%貼壁，細胞生長良好融合成單層后再傳代。

1.2.1.3 體外培養細胞懸液的配制 取生長良好的第四代成骨細胞，0.25%胰蛋白酶消化，毛細吸管吹打使貼壁細胞脫落，顯微鏡下記數，調整細胞數為5×107個/L，接種入96孔板中，用加入含20%胎牛血清的DMEM培養基200μL培養6h，制成細胞懸液。

1.2.1.4 MTT比色法檢測 待細胞貼壁生長后舍棄原培養液， 分別加入含50g/L新調制的對照組制劑培養液，新鮮DMEM培養液，實驗組浸提液， 用96孔板每個實驗組6孔，放入培養箱中培養，于3d、5d更換材料浸提液，于培養后1、3、5、7d 各取一塊培養板，然后每孔加入20μlMTT(5g/L) 溶液后37℃孵箱繼續培養4h，小心吸出每孔內的浸提液，加入二甲基亞砜每孔150μl，室溫下16min后振蕩器振蕩培養板10min使結晶物充分溶解染色均勻，用酶聯免疫檢測儀在500nm波長測定各孔光吸收值，取6孔均值為樣本檢測值。

1.2.2 根管密合性檢測 收集近期拔除的單根離體牙10顆。標準：牙齒包括根尖孔，發育正常，無病變及折裂傷。刮凈結石及牙周膜纖維，放生理水中備用。10顆離體牙隨機分成實驗組及對照組。開髓，根管預備至40＃，紙尖吸干根管，室溫放置。將各組根充后的牙齒拍Ｘ光片證實所有牙根均完善充填。待材料充分硬固后，進行微滲漏試驗并檢測葡萄糖濃度。

1.2.3 根管充填材料的抑菌實驗 用瓊脂稀釋法，提取3～5個大小菌落入布氏培養液中作厭氧培養，24h后將二種菌按1:10稀釋并校正為1.5×108CFU/ml濃度待用，并將2種根充糊劑分別稀釋至0.9ug/ml待用。采用打孔瓊脂擴散法，將瓊脂均勻注入培養皿，待凝固后，用直徑為1cm的打孔器打孔，每個平板上均勻打孔2個，挑出孔中瓊脂，在孔中注入瓊脂1.0ml封孔底. 將校正后菌液涂布于均勻平皿表面，每種菌需涂布于3塊培養皿上，將稀釋的根充糊劑100mg加入后，將各培養皿置于37℃恒溫箱內培養48h觀察結果。使用卡尺測量加藥孔周圍無菌生長區域的大小，即抑菌環直徑，測抑菌環的最大直徑和最小直徑取均值。

1.3 統計學分析 應用SPSS11.5統計軟件進行數據處理，采用單因素方差分析和t檢驗。

2 結果 實驗組和陰性對照組細胞毒性無顯著性差異（P＞0.05）；實驗組與陽性對照組有顯著差異（P＜0.05），見表1。實驗組與對照組根管密合度之間有顯著性差異（P＜0.05），見表2。實驗組與對照組抑菌試驗之間無顯著性差異（P＞0.05）見表3、表4。

表1 對照組及實驗組OD值（略）

表2 根充材料葡萄糖滲出量組別葡萄糖濃度 （略）

表3 金黃色葡萄球菌抑菌環直徑（略）

表4 變形鏈球菌抑菌環直徑（略）

3 討論

3.1 細胞毒性研究 納米羥基磷灰石微結構類似于天然骨基質，可提高材料的生物活性、利用度和生物相容性，可提供適宜的環境促進膠原和礦物的沉積以及成骨細胞的黏附，納米羥基磷灰石提供了一個更適合骨形成細胞生長的界面從而促進與骨的結合［1］。充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑封閉劑導致根尖應急炎癥反應，這可能是從材料中游離出的酚、醛［2］與組織液接觸導致了持續的炎癥反應，會在短時間內釋放大量的酚和醛:一方面酚通過抑制前列腺紊和白細胞介素的合成使尖周炎癥緩解另一方面酚可抑制尖周神經的活性，影響細胞介導的免疫反應，低濃度的酚能激活抑制性T細胞，高濃度的油酚卻殺傷該細胞而對尖周組織產生細胞毒作用，但是硬固后毒性降低。 MTT比色法可以準確、快速、靈敏地反映細胞增殖程度和細胞毒性程度［3］，因此MTT比色法用于評價材料細胞毒性的常用實驗方法［4］。將細胞增殖度法與細胞的形態學觀察相結合，可以更加有效地評價材料的細胞毒性，細胞毒性與被測材料的量尤其是表面積有關［5］。每孔所選用的細胞數量原則上應以避免引起細胞融合為宜［6］。本實驗通過吸光度值檢測，反映材料對細胞的毒性作用，結果顯示，實驗組及陰性對照組細胞毒性無顯著性差異，實驗組與陽性對照有顯著差異，說明實驗組的細胞毒性小，生物相容性良好，表明實驗組符合生物體應用的基本要求，可以進行活體組織的后續實驗。

3.2 根管密合度研究 理想的根充材料應當具有優良的封閉性性，能夠嚴密封閉根尖孔。如果封閉性能不良會引起根管充填不嚴密而造成微滲漏現象，導致根管內的細菌再感染，最終可導致根管治療失敗。20nm羥基磷灰石顆粒，與牙齒硬組織相似，比一般的生物體內的細胞都小，提高了韌性和力學性能，增強了流動性，采用的納米羥基磷灰石顆粒可以滲透至牙本質深部，而形成較好的封閉性能。對照組可溶解性發生在根管內，根尖充填中對照組的消失使根尖受腐蝕而密合度降低。

3.3 抑菌性研究 根管治療是當前國內外治療感染根管的主要方法，遺留在根管系統中的細菌和殘余牙髓組織等可能成為根管治療失敗的主要原因。根充糊劑是否具有良好的抑菌作用成為重要因素，患牙根管內以厭氧菌為主的混合菌感染［7］，本實驗結果表明，實驗組具有較強的抑菌性，碘仿起到了防腐殺菌的主要作用。碘仿是一種良好的消毒劑和防腐劑，具有很強的殺菌和局部抗感染能力，與組織親和力強，且對組織刺激性小。碘仿遇到組織液或細菌產物時可緩慢分解釋放游離碘，與菌體蛋白質的氨基酸結合使其變性，使細菌產生氧化，起到殺菌作用，尤其對厭氧菌的殺滅作用更強，從而有效地消除再感染，碘仿還對吸收根管內滲出物，促進根尖病灶的吸收，減少滲出也有一定的改善作用。納米材料具有較大的表面積，對細菌具有高吸附力，大量吸附與細菌代謝相關的酶，從而干擾細菌的代謝［8］。羥基磷灰石本身為堿性，不利于細菌生長。對照組發生在根管內的溶解，單獨使用充填根管會使根尖再受污染。

4 結論 （1）納米羥基磷灰石復合根管充填劑有很好的安全性和良好的生物相容性，不會干擾生物細胞的正常功能。（2）納米羥基磷灰石根充糊劑的根管密合度優于傳統的充填用復方麝香草酚散甲醛甲酚復合制劑。（3）納米羥基磷灰石根充糊劑具有良好的抑菌性。可作為根管充填材料，有良好的應用前景。