作者：張華斌 張朝暉 聶燕 胡宇芳 鄒海英 姚守拙

【摘要】 在多壁碳納米管表面接枝的雙鍵鍵合，以綠原酸為模板，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，采用沉淀聚合技術(shù)，在碳納米管表面成功制備綠原酸印跡材料。采用紅外光譜、掃描電鏡和熱重分析研究此印跡材料的性能。結(jié)果表明，在碳納米管表面接枝一層穩(wěn)定、均勻、30～40 nm厚的印跡材料。采用高效液相色譜研究此印跡材料的吸附動力學(xué)及吸附容量，實驗結(jié)果表明，此印跡材料對綠原酸的結(jié)合存在兩個結(jié)合位點，最大吸附容量Qmax分別為21.5和32.７ μmol/g。以此印跡材料作為固相萃取劑，優(yōu)化萃取條件，成功應(yīng)用于金銀花提取液中綠原酸的富集分離研究，富集因子達25。

【關(guān)鍵詞】 多壁碳納米管，分子印跡，綠原酸，分離

Abstract A novel molecularly imprinted polymers (MIPs) was prepared based on multiwalled carbon nanotubes (MWNTs) by using chlorogenic acid as template， methacrylic acid(MAA) as the functional monomer， and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as the crosslinker. Infrared spectroscopy， scanning electron microscopy， and thermogravimetric analysis were employed to characterize the composite structure and morphology， the results showed that a stable imprinted layer was grafted on the MWNTs with the average thickness of 30－40 nm. The dynamic adsorption and static adsorption experiments were also executed and the results showed that two kinds binding sites with the maximum apparent binding constant 21.5 μmol/g and 32.７ μmol/g existed v.i. between the imprinted polymers and chlorogenic acid. As solid phase extraction (SPE) materials， the separation and enrichment of chlorogenic acid from honeysuckle were successful with a enrichment factor of 25.

Keywords Multiwalled carbon nanotubes， molecularly imprinted， chlorogenic acid， separation

1 引 言

分子印跡技術(shù)是一種合成具有特異性識別位點和預(yù)定選擇性聚合物的技術(shù)，該技術(shù)已經(jīng)在諸多領(lǐng)域得到應(yīng)用，如固相萃取、手性分離、化學(xué)傳感等[1～3]。最近，有科研工作者以碳納米管為基材，結(jié)合印跡技術(shù)，制備具有高選擇性和高吸附容量的碳納米管分子印跡聚合物(MWNTsMIPs)，并成功用于電化學(xué)等領(lǐng)域研究[4～10]，但在色譜研究領(lǐng)域卻鮮有報道。本實驗以多壁碳納米管為基體，通過酰胺化反應(yīng)在碳納米管表面接枝碳碳雙鍵，以綠原酸為模板，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，通過熱聚合在碳納米管表面接枝綠原酸印跡層。對此印跡材料進行掃描電鏡分析、紅外分析、熱重分析和高效液相色譜分析，并成功應(yīng)用于金銀花粗提液中綠原酸的固相萃取。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LC10AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；S3400N掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；WGH30A型雙光束紅外分光光度計(天津港東科技發(fā)展有限公司)；WCT2C型微機差熱天平(北京光學(xué)儀器廠)；臺式高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)。 多壁碳納米管(MWNTs，30～40 nm， 純度>99%， 深圳比爾科技公司)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(CA，中國藥檢局)；金銀花(湖南吉首市)；甲基丙烯酸(MAA，Sigma公司)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，Sigma公司)，使用前蒸餾除去阻聚劑。偶氮二異丁腈(AIBN，北京化工廠)、HNO3、二氯亞砜(SOCl2)、N，N′二甲基甲酰胺(DMF)、丙烯酰胺(AM)、乙腈(ACN)、醋酸、醋酸鈉、甲醇和乙醇除特殊說明外，均為分析純試劑。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 MWNTsCONHCHCH2的制備

稱取500 mg MWNTs，加入50 mL濃HNO3，超聲10 min， 85 ℃下回流攪拌24 h。冷卻后，將反應(yīng)液稀釋10倍，用0.45 μm微孔濾膜減壓抽濾。濾餅采用二次蒸餾水反復(fù)洗滌至中性，于85 ℃真空干燥24 h，得到MWNTsCOOH，稱重備用。

稱取450 mg MWNTsCOOH，加入50 mL SOCl2，于70 ℃回流攪拌24 h。反應(yīng)完成后，常壓蒸餾出未反應(yīng)的SOCl2，然后加入3.0 g AM和100 mL DMF，溶液超聲10 min，在45 ℃回流24 h。采用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾餅先以0.12 mol/L HCl洗滌，再用水洗至中性，于70 ℃真空干燥24 h，得到MWNTsCONHCHCH2，稱重備用。

2.3 印跡材料(MWNTsMIPs)的制備

綠原酸印跡材料的合成條件如表1所示。稱取適量MWNTsCONHCHCH2和綠原酸，再依次加入MAA、EGDMA、AIBN和ACN。溶液通氮氣10 min，將反應(yīng)器密封。再超聲10 min，靜置1 h，然后于60 ℃下攪拌反應(yīng)24 h?？瞻子≯E材料(MWNTsNIPs)的制備除不加模板分子外，其它步驟相同。 聚合物冷卻至室溫，以10000 r/min離心收集聚合物沉淀，用20%醋酸甲醇溶液(V/V)反復(fù)洗滌以除去模板分子及未聚合的功能單體和交聯(lián)劑，然后用無水甲醇洗脫醋酸，每次洗脫液都以10000 r/min離心10 min，收集產(chǎn)物于90 ℃真空干燥24 h，得到MWNTsMIPs。表1 MWNTsMIPs的聚合條件（略） 2.4 印跡固相萃取

2.4.1 優(yōu)化固相萃取條件

稱取300 mg MWNTsMIPs和MWNTsNIPs，采用干法裝入固相萃取柱中，兩端用玻璃棉封堵。填充柱先用10 mL甲醇清洗，再用蒸餾水清洗。對固相萃取過程的工藝優(yōu)化如下：首先上樣10 mL 0.5 mmol/L綠原酸乙醇溶液，打開真空泵，控制流速0.5 mL/min，用乙醇淋洗除去非特異性吸附的干擾物質(zhì)后，使用50 mL不同pH值的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液甲醇(2∶8， V/V)洗脫劑洗脫被萃取柱保留的模板分子，收集含有綠原酸的洗脫液，濃縮再定容，用HPLC分析。通過對比洗脫液中綠原酸含量和上樣中綠原酸含量計算回收率。使用空白印跡材料做對照實驗。

2.4.2 金銀花中綠原酸的富集

采用與2.４.1節(jié)優(yōu)化后的方法上樣10 mL金銀花的乙醇粗提液，采用50 mL pH 3.3的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液甲醇(2∶8， V/V)洗脫劑洗脫，流速控制為0.5 mL/min， 采用HPLC檢測接收液， 考察綠原酸在MWNTsMIPs固相萃取材料上的保留情況。

2.5 色譜條件

實驗中所有的HPLC測定的色譜條件相同，即：VPODS C18色譜柱(150 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃；流動相：V(甲醇)∶V(水)=40∶60，流速1.0 mL/min；檢測波長327 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 MWNTsMIPs的聚合與表征

3.1.1 MWNTsMIPs的聚合

可以根據(jù)需要在碳納米管表面接枝不同的官能團。本實驗利用酰胺化反應(yīng)，在碳納米管表面接枝丙烯酰胺的雙鍵，使MWNTs與MIPs之間實現(xiàn)共價鍵連接，聚合過程如下：

3.1.2 電鏡分析

采用掃描電鏡對MWNTs和MWNTsMIPs進行形貌表征，如圖1所示。從圖1a中可以清晰的看到MWNTs呈單一的納米管狀，其管徑約為30～40 nm。同樣放大30000倍可見，MWNTsMIPs已經(jīng)均勻變粗，管徑約為100～120 nm，這表明綠原酸印跡材料均勻地接枝在MWNTs上，由此估算出接枝在碳納米管表面的印跡材料的厚度約為30～40 nm。

3.1.3 熱重分析

MWNTs和MWNTsMIPs的熱重分析結(jié)果如圖2所示。在100 ℃內(nèi)都有未干燥完全的溶劑(水，乙腈等)揮發(fā)；在100～600 ℃之間MWNTs沒有明顯失重，而MWNTsMIPs有兩處明顯的失重，這兩種失重可能是因為MIPs與MWNTs的兩種不同包覆，在350 ℃附近的失重是物理性的包覆，而400～600 ℃間的失重是存在化學(xué)鍵的包覆。因此，扣除溶劑的失重?fù)p失(在100 ℃之前)，估算出MWNTs表面MIPs的接枝率約為83%。

3.1.4 紅外光譜分析

圖3是MWNTsMIPs、MWNTsCONHCHCH2和MWNTs的IR譜圖。譜線a中3600～2900 cm－１之間較寬的吸收峰是CH3和NH的伸縮振動峰重疊的結(jié)果；1733 cm－１是CO伸縮振動峰，1171 cm－１是CO的對稱振動峰。在MWNTsCONHCHCH2(譜線b)中，1628 cm－１處有CC振動峰。而3315和1679 cm－１分別是酰胺化的締合NH伸縮振動峰及CO峰。

3.2 MWNTMIPs的吸附動力學(xué)

稱取一系列50 mg分子印跡材料，置于10 mL吸附管中，分別加入10 mL 0.5 mmol/L綠原酸甲醇溶液，于25 ℃恒溫振蕩器中振蕩10、45、80、120、200、300和500 min后，10000 r/min離心，用高效液相色譜(HPLC)測定上層清液中綠原酸的濃度，平行測定3次，取平均值，差減法計算印跡材料對綠原酸的結(jié)合量Q(μmol/g)。MWNTsMIPs對綠原酸的吸附動力學(xué)的結(jié)果如圖4所示。對圖4作S形擬合，可以發(fā)現(xiàn)在120 min前，MWNTsMIPs的吸附量隨時間增加迅速增大，表明在此階段的吸附速度很快，但是在120 min后，就趨于平衡，表明吸附容量達到飽和而不再增加。

3.3 印跡材料的吸附性能

稱取一系列50 mg分子印跡聚合物，置于10 mL吸附管中，分別加入0～4.00 mmol/L的不同濃度的綠原酸甲醇溶液，放入25 ℃恒溫振蕩器中振蕩12 h，10000 r/min離心，用ＨＰＬＣ測定上層清液中綠原酸的濃度，平行測定3次，取平均值，差減法計算印跡材料對綠原酸的結(jié)合量Q(μmol/g)。采用靜態(tài)吸附法，測定了MWNTsMIPs對不同濃度綠原酸的吸附等溫線，結(jié)果見圖5a。將圖５a中數(shù)據(jù)進行Scatchard模型[2]分析，以Q/C對Q作圖可得到圖5b。由圖5b可見，Q/C對Q呈非線性關(guān)系; 但圖5b中兩個部分呈線性關(guān)系，表明MWNTsMIPs對綠原酸存在兩種不同結(jié)合位點。高結(jié)合位點的離解常數(shù)Kd1=0.13 mmol/L，最大吸附量Qmax1=21.5 μmol/g；低結(jié)合位點的離解常數(shù)Kd2=0.76 mmol/L，最大吸附量Qmax2=32.７ μmol/g。

分別比較甲醇、乙醇和水配制的綠原酸溶液進行固相萃取的效果， 發(fā)現(xiàn)綠原酸的乙醇溶液吸附率達到100%， 而甲醇和水溶液的吸附率約70%。由于模板分子與功能性單體之間發(fā)生的主要是氫鍵作用，弱極性溶劑配制的樣品更有助于模板分子與萃取材料的結(jié)合，上樣溶劑的極性過大將干擾模板分子與印跡孔穴氫鍵作用，3種溶劑極性以乙醇最弱。因此本實驗選取廉價的乙醇作為上樣溶劑及淋洗液。

將綠原酸分別在MWNTsMIPs與MWNTsNIPs固相萃取柱上進行吸附和洗脫，檢測結(jié)果見表2。用不同pH值（3.3、4.5、6.6和7.9）的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液甲醇（2∶8， V/V）為洗脫液時，pH越低，回收率越高，這可能是乙酸的羧基與功能單體競爭性地與模板分子作用，破壞模板分子與印跡位點間的氫鍵作用，從而使模板分子從印跡位點被釋放。當(dāng)pH<3.3， 再降低pH值，洗脫效果無明顯提高。同時乙酸濃度過高會降低萃取柱使用壽命，所以最終選擇20%醋酸/醋酸鈉（pH 3.3）甲醇溶液為洗脫液。表2 綠原酸的回收率（略）

金銀花的粗提液分別通過MWNTsMIPs和MWNTsNIPs固相萃取柱，以乙醇為淋洗液，pH 3.3的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液甲醇溶液為洗脫液進行固相萃取，洗脫液用HPLC檢測，色譜圖如６所示。上樣液中綠原酸含量約3%，在pH=3.3醋酸/醋酸鈉緩沖溶液甲醇（2∶8， V/V）的洗脫下，綠原酸在MWNTsMIPs柱得到分離和富集，含量提升到90%，富集因子約為25倍。