作者：李娜 喬光明 禚林海 唐波

【摘要】 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)核心技術(shù)之一，研究提高PCR擴(kuò)增效率的方法具有重要意義。傳統(tǒng)提高PCR擴(kuò)增效率的方法具有較多局限性，使得PCR擴(kuò)增仍不能達(dá)到理想的效果。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料具有特殊的表面效應(yīng)和尺寸效應(yīng)，表面能進(jìn)行多種修飾，易與生物大分子蛋白質(zhì)、核酸等相互作用，對(duì)生物分子的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生特別的影響。研究利用納米材料來(lái)提高PCR擴(kuò)增效率的技術(shù)和方法，具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本文引用文獻(xiàn)41篇，綜述了近年來(lái)納米材料在PCR體系中應(yīng)用的現(xiàn)狀，并展望了今后納米材料在PCR體系中應(yīng)用的發(fā)展方向及其前景。

【關(guān)鍵詞】 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；納米材料；特異性；擴(kuò)增效率；評(píng)述

Application Progresses of Nanomaterials on Polymerase Chain ReactionLI Na，QIAO Guang-Ming，ZHUO Lin-Hai，TＡＮＧ Bo*(College of Chemistry，Chemical Engineering and Materials Science，Key Laboratory of Molecular and Nano Probes，Ministry of Education，Engineering Research Center of Pesticide and Medicine Intermediate Clean Production，Ministry of Education，Shandong Normal University，Jinan 250014)Abstract Polymerase chain reaction possesses very important academic and application meanings to study the ways and technologies of improving the efficiency of PCR based on nanomaterials.In this review，recent application status of nanomaterials on PCR was summarized with 41 references.Particularly，the developing trends and prospects in the future were also discussed.Keywords Polymerase chain reaction； Ｎanomaterials； Ｓpecificity； Ａmplication efficiency； Ｒeview

1 引言

1983年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[1]，并因此榮獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR可使目的DNA分子的合成量呈指數(shù)增長(zhǎng)，因此微量的遺傳物質(zhì)在數(shù)小時(shí)內(nèi)即能擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍[2，3]達(dá)到檢測(cè)水平，進(jìn)而可進(jìn)行測(cè)序[4]、DNA探測(cè)[5，6]、基因分析[7~9]、食品檢驗(yàn)[10，11]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[12，13]等。PCR技術(shù)具有特異、敏感、快速、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)，徹底改革了分子遺傳學(xué)，成為現(xiàn)代生物學(xué)和藥物科學(xué)最流行的技術(shù)之一，與克隆、DNA序列分析方法構(gòu)成了整個(gè)現(xiàn)代分子生物學(xué)研究工作的基礎(chǔ)。盡管PCR已發(fā)展成為一項(xiàng)相當(dāng)成熟的技術(shù)，但在實(shí)際操作中，PCR擴(kuò)增始終存在一些難以克服的問(wèn)題，如假陰性、假陽(yáng)性、非特異性擴(kuò)增以及片狀拖帶或涂抹帶等，尋找解決PCR中這些問(wèn)題的方法至關(guān)重要，通常的辦法有向PCR體系中添加各種增效劑[14，15]，優(yōu)化PCR體系的各種參數(shù)[16，17]，改進(jìn)PCR的擴(kuò)增策略[18，19]等，這些方法雖然在一定程度上提高了PCR的特異性、產(chǎn)量以及效率，但是并未徹底解決上述難題，PCR擴(kuò)增仍達(dá)不到理想的預(yù)期效果。近年來(lái)，人們?cè)噲D從新興學(xué)科與技術(shù)中尋找優(yōu)化PCR的方法。納米生物技術(shù)由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)性越來(lái)越受到人們的關(guān)注[20]。尺寸小于100 nm（與生物分子的尺寸相當(dāng)）的納米材料在生物醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用[21，22]，人們已將多種納米材料引入傳統(tǒng)的PCR技術(shù)中。

2 納米材料對(duì)PCR體系的影響

2.1 金納米粒子對(duì)PCR體系的影響

Li等[23]將10 nm的金納米粒子作為一種新型的優(yōu)化劑添加到PCR體系中，考察了金納米粒子對(duì)PCR特異性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金納米粒子的濃度介于0.4～0.8 nmol/L之間時(shí)，隨著金納米粒子濃度的不斷增高，PCR的特異性越來(lái)越好；但當(dāng)金納米粒子濃度大于1.0 nmol/L時(shí)，PCR的特異性又被抑制。而且，加入金納米粒子在保持PCR產(chǎn)量和特異性的前提下，可以拓寬PCR體系的退火溫度范圍，退火溫度即使低至25 ℃，PCR仍具有較好的特異性。Li等[23]認(rèn)為金納米粒子模擬了體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程中單鏈結(jié)合蛋白SSB的作用，選擇性地結(jié)合了單鏈DNA，而不是雙鏈DNA，從而顯著降低了DNA復(fù)制過(guò)程中引物和模板的錯(cuò)配。此前，Perales等[24]通過(guò)模擬生物體內(nèi)的擴(kuò)增策略，成功地將耐熱的SSB蛋白引入到PCR體系中，提高了PCR的特異性。

Vu等[25]深入探討了金納米粒子對(duì)PCR體系特異性的影響。發(fā)現(xiàn)金納米粒子的作用不是增加PCR的特異性，而是更有利于小片段產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制大片段產(chǎn)物的產(chǎn)生，不論該小片段產(chǎn)物是特異性產(chǎn)物還是非特異性產(chǎn)物。而且，隨著金納米粒子濃度的增加，這種作用越來(lái)越明顯。他們認(rèn)為金納米粒子能促進(jìn)小片段的擴(kuò)增，是因?yàn)榧{米金與聚合酶發(fā)生了非特異性結(jié)合，是表面化學(xué)作用起到重要作用。

Li等[26]研究了13 nm的金納米粒子對(duì)PCR體系效率的影響。實(shí)驗(yàn)表明，金納米粒子能使PCR體系的產(chǎn)量提高104～106倍，反應(yīng)時(shí)間越短，金納米粒子對(duì)PCR體系產(chǎn)量的提高就越明顯。而且，相同量的金納米粒子對(duì)不同升降溫速度的PCR體系的影響不同。與不加金納米粒子的PCR體系相比，金納米粒子對(duì)升/降溫速度為20 ℃/S的實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)量的提高可高達(dá)104倍， 而對(duì)升/降溫速度為2 ℃/S的普通PCR體系， 金納米粒子對(duì)其產(chǎn)量的提高只有5～10倍，PCR體系的熱循環(huán)越快，金納米粒子對(duì)PCR產(chǎn)量的提高就越大。Li等[26]認(rèn)為，金具有良好的熱傳導(dǎo)性，改善了快速升降溫PCR體系的熱傳導(dǎo)性，有利于模板與引物更高效的配對(duì)，從而提高了PCR的產(chǎn)量，優(yōu)化了PCR體系。

對(duì)于金納米粒子與PCR各參數(shù)的相互作用，文獻(xiàn)[27，28]報(bào)道了引物共價(jià)鍵合到金納米粒子表面的PCR。結(jié)果表明，一條引物（上游引物或者下游引物）或者兩條引物連接到金納米粒子上，在一定范圍內(nèi)，退火溫度對(duì)PCR體系幾乎沒(méi)有影響，PCR特異性均較好。

米麗娟等[29]研究PCR體系中納米金與DNA聚合酶的相互作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的納米金之所以會(huì)抑制PCR擴(kuò)增，是因?yàn)榧{米金與聚合酶發(fā)生了相互作用。若提高聚合酶用量，可有效消除金納米粒子的這種抑制作用。在PCR體系中，納米金通過(guò)與游離的DNA聚合酶的可逆結(jié)合，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)聚合酶的濃度，進(jìn)而影響PCR的擴(kuò)增結(jié)果。但該機(jī)理僅從納米金與聚合酶的相互作用出發(fā)，考慮到PCR體系的復(fù)雜性，納米金還有可能與模板、引物等發(fā)生了復(fù)雜的相互作用，更為確切的調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

納米金還可以?xún)?yōu)化PCR的擴(kuò)增策略。 Pan等[30]研究基于納米金的多輪擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，由于納米金可以抑制PCR的非特異擴(kuò)增，可以將PCR的有效擴(kuò)增極限推到第7輪，即使在第6輪擴(kuò)增中也能得到單一明亮的目標(biāo)條帶。而在常規(guī)PCR多輪擴(kuò)增中，無(wú)論對(duì)DNA模板如何稀釋?zhuān)行U(kuò)增只能進(jìn)行到第3輪，且隨著擴(kuò)增輪數(shù)的增加，目標(biāo)產(chǎn)物的量也呈下降趨勢(shì)。納米金輔助的PCR再擴(kuò)增和多輪擴(kuò)增在一定程度上可取代巢式PCR，避免了巢式PCR需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物的繁瑣。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，表面修飾了BPS、莖環(huán)DNA、以及Triton-100的金納米粒子，雖然表面性質(zhì)發(fā)生了改變，但是仍然能提高PCR的特異性和產(chǎn)量。

2.2 銀納米粒子對(duì)PCR體系的影響

王群等[31]探討了銀納米粒子對(duì)PCR體系長(zhǎng)片段DNA反復(fù)擴(kuò)增的特異性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)長(zhǎng)度為3~6 kb的較長(zhǎng)片段基因，銀納米粒子在一定程度上保持了其PCR反復(fù)擴(kuò)增的特異性；而對(duì)10 kb以上更長(zhǎng)片段的反復(fù)擴(kuò)增，銀納米粒子對(duì)其特異性的影響比較小。他們認(rèn)為，可能是銀納米粒子性改善了常規(guī)PCR體系溶液的導(dǎo)熱性能，縮短了整個(gè)體系達(dá)到溫度平衡所用的時(shí)間，從而抑制了非特異擴(kuò)增；也可能是銀納米粒子與不同狀態(tài)DNA分子發(fā)生了選擇性結(jié)合，從而提高了擴(kuò)增的特異性。 2.3 磁性納米粒子對(duì)PCR體系的影響

Shen等[27，32]研究了將引物共價(jià)鍵合到SiO2包覆的γ-Fe2O3磁性納米粒子表面的PCR。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引物連接到γ-Fe2O3磁性納米粒子表面，在合適的條件下，PCR反應(yīng)能順利進(jìn)行。當(dāng)一條引物（上游引物或下游引物）連接在γ-Fe2O3磁性納米粒子表面，而另一條引物（下游引物或上游引物）未連接時(shí)，PCR幾乎不受退火溫度的影響；但當(dāng)兩條引物都連接在γ-Fe2O3磁性納米粒子表面時(shí)，PCR受退火溫度的影響較大。在一定溫度范圍內(nèi)，退火溫度越高，PCR產(chǎn)物特異性越好。而且，將引物與磁性納米粒子連接，產(chǎn)生了新的基于磁性納米粒子的不對(duì)稱(chēng)PCR和對(duì)稱(chēng)PCR。一條引物連接到磁性納米粒子表面的不對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增可以產(chǎn)生大量磁性納米粒子-單鏈DNA復(fù)合物，由于單鏈DNA產(chǎn)物連接在磁性納米粒子的表面，所以利用外磁場(chǎng)作用可以很容易地將其分離；而兩條引物均連接到磁性納米粒子表面的對(duì)稱(chēng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生了一種生產(chǎn)納米結(jié)構(gòu)聚合物的新方法。

2.4 納米碳對(duì)PCR體系的影響

2.4.1 納米碳管對(duì)PCR體系的影響 Cui等[33]發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管（SWNTS）能對(duì)PCR產(chǎn)生積極的影響。當(dāng)SWNTS濃度小于3 g/ L時(shí)，能增加PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量；而當(dāng)SWNTS濃度大于3 g/L時(shí)，又會(huì)抑制PCR反應(yīng)。此外，SWNTS還可以在一定程度上模擬PCR緩沖液中Mg2+的重要作用。當(dāng)PCR反應(yīng)液中沒(méi)有Mg2+時(shí)，加入SWNTS能得到與Mg2+存在時(shí)相似的效果，PCR的產(chǎn)量沒(méi)有太大的差別，都是在SWNTS濃度為3 g/L時(shí)得到最大產(chǎn)量。為了探求實(shí)驗(yàn)的機(jī)理，他們將SWCNTS分別與DNA、Taq酶進(jìn)行了孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些反應(yīng)成分聚集在SWCNTS周?chē)?，能更好的接觸而發(fā)生反應(yīng)，因而能提高PCR的效率，增加PCR反應(yīng)的產(chǎn)量。當(dāng)SWNTS濃度過(guò)高時(shí)，因其對(duì)PCR反應(yīng)成分的過(guò)多連接而破壞了DNA，Tag酶以及引物的反應(yīng)條件，從而抑制了PCR反應(yīng)。而且通過(guò)X-射線電子光譜圖分析發(fā)現(xiàn)，在PCR反應(yīng)后，SWCNTS的結(jié)合能增加，說(shuō)明其與DNA模板、Taq聚合酶發(fā)生了強(qiáng)烈的反應(yīng)，SWCNTS與PCR各反應(yīng)成分發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移，充當(dāng)了電子受體和聚合酶的穩(wěn)定劑。

2.4.2 納米碳粉對(duì)PCR體系的影響 Zhang等[34]發(fā)現(xiàn)納米碳粉（CNP）的水懸浮溶液能提高重復(fù)PCR和長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增的特異性。在沒(méi)有CNP的情況下，重復(fù)PCR在第4輪擴(kuò)增就開(kāi)始出現(xiàn)非特異性條帶。第5和第6輪擴(kuò)增出現(xiàn)了明顯的拖尾，幾乎沒(méi)有目標(biāo)條帶。而加入適量的CNP懸浮液后，PCR即使到了第6輪擴(kuò)增也能得到單一的目標(biāo)條帶。同時(shí)，在長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增中加入CNP懸浮液可以使拖尾現(xiàn)象顯著減少，非特異條帶逐漸消失。但是，CNP的濃度必須在一定范圍內(nèi)才會(huì)有效，濃度太低不能有效提高PCR的特異性，濃度過(guò)高又會(huì)抑制PCR反應(yīng)。原子力顯微鏡結(jié)果說(shuō)明CNP與雙鏈DNA之間存在潛在的結(jié)合力，因此反應(yīng)的機(jī)理可能是這種結(jié)合力減少了引物與DNA模板之間的錯(cuò)配以及引物二聚體的產(chǎn)生，因而可以提高PCR的特異性。但過(guò)高濃度的CNP會(huì)產(chǎn)生過(guò)高的結(jié)合力，又會(huì)阻礙PCR的反應(yīng)。但是CNP對(duì)PCR有這樣的影響，還有可能是CNP與DNA聚合酶發(fā)生了相互作用，反應(yīng)機(jī)理尚需進(jìn)一步探討。

2.4.3 富勒烯（C60）對(duì)PCR反應(yīng)的抑制作用 張捷等[35]研究了富勒烯(C60)對(duì)PCR的影響。隨著C60濃度的增加，PCR擴(kuò)增被顯著抑制。C60一方面會(huì)抑制DNA聚合酶的活性，且濃度越高，抑制作用越大，另一方面又會(huì)損傷DNA單鏈模板，降低DNA單鏈模板起始濃度，從而造成PCR產(chǎn)物量的降低。他們認(rèn)為，這是C60與DNA聚合酶的酶活性位點(diǎn)發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致DNA聚合酶活性降低，同時(shí)C60還會(huì)結(jié)合到DNA單鏈模板上，干擾引物、底物與模板之間的精確配對(duì)，另外，C60可在PCR實(shí)驗(yàn)條件下活化生成多種活性氧或自由基，進(jìn)而造成DNA聚合酶構(gòu)象的改變以及DNA模板的損傷，抑制了PCR反應(yīng)的進(jìn)行。

2.5 半導(dǎo)體納米材料對(duì)PCR體系的影響

Nie等[36]發(fā)現(xiàn)表面帶氨基的SiO2包覆的四足狀ZnO納米結(jié)構(gòu)能提高PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。由SiO2包覆的四足狀ZnO，當(dāng)表面有氨基修飾并且加入量由0.01 μg逐漸增大到0.5 μg時(shí)，PCR產(chǎn)物的量不斷增多；當(dāng)加入量＞0.5 μg時(shí)，PCR產(chǎn)物的量卻不再增加。表面修飾了氨基的ZnO納米結(jié)構(gòu)在一定濃度范圍內(nèi)能提高PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。當(dāng)表面沒(méi)有氨基修飾，ZnO納米結(jié)構(gòu)的量≤0.06 μg時(shí)，PCR產(chǎn)物的量變化不大；而當(dāng)ZnO納米結(jié)構(gòu)的量≥0.12 μg時(shí)，PCR產(chǎn)物的量減少。其反應(yīng)機(jī)理還不明確。

Wang等[37]考察了表面修飾了羧基的CdTe量子點(diǎn)對(duì)PCR體系特異性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同的退火溫度下，CdTe量子點(diǎn)能提高PCR體系的特異性，而且在擴(kuò)增短片段時(shí)，量子點(diǎn)對(duì)PCR體系特異性的提高比擴(kuò)增長(zhǎng)片段時(shí)提高的更明顯。同時(shí)，CdTe量子點(diǎn)不能提高PCR的效率。CdTe量子點(diǎn)可以作為常規(guī)PCR的優(yōu)化因子，尤其是對(duì)多重PCR，因而可以拓寬PCR的應(yīng)用范圍，同時(shí)也對(duì)基因診斷具有重要的意義。他們認(rèn)為反應(yīng)機(jī)理可能有兩方面：（1）與金納米粒子相似，CdTe量子點(diǎn)模擬了體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程中單鏈結(jié)合蛋白SSB的作用，選擇性地結(jié)合了單鏈DNA，從而顯著降低了DNA復(fù)制過(guò)程中引物和模板的錯(cuò)配，有利于提高PCR的特異性；（2） CdTe量子點(diǎn)可能與DNA聚合酶發(fā)生了相互作用，聚合酶吸附到量子點(diǎn)的表面，使PCR體系中聚合酶的有效濃度降低，從而有利于目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高了PCR的特異性。但隨著量子點(diǎn)的不斷增多，聚合酶濃度不斷降低，當(dāng)聚合酶濃度小于特異擴(kuò)增需要的有效濃度時(shí)，量子點(diǎn)的加入又會(huì)對(duì)PCR產(chǎn)生抑制作用。

另外，還有不少學(xué)者研究了半導(dǎo)體納米材料對(duì)PCR體系的抑制作用。早期有學(xué)者將微米級(jí)的硅顆粒以及表面經(jīng)過(guò)處理的硅加入到PCR體系中[38，39]，發(fā)現(xiàn)微米級(jí)的硅對(duì)PCR過(guò)程有較明顯的抑制作用。王瑋等[40]將納米級(jí)的硅引入PCR體系中，探討了表面氧化程度不同的硅納米顆粒對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制作用及其機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著硅材料表面積與PCR反應(yīng)體系體積比的增大，核酸擴(kuò)增效率明顯下降；并且在所研究的范圍內(nèi)，表面氧化程度越高的硅納米顆粒對(duì)PCR的抑制作用越強(qiáng)。對(duì)抑制作用機(jī)理的初步研究表明， 硅納米顆粒對(duì)PCR反應(yīng)液中Taq酶的吸附是導(dǎo)致抑制現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因。而對(duì)模板的吸附對(duì)PCR的影響較小，而且，硅納米顆粒本身對(duì)PCR沒(méi)有明顯的直接化學(xué)抑制作用。

李世強(qiáng)等[41]考察了在避光條件下，銳鈦礦型納米TiO2對(duì)PCR體系的影響，結(jié)果表明，納米TiO2對(duì)PCR體系有抑制作用。隨著納米TiO2量的增加，對(duì)DNA合成的抑制也越強(qiáng)，且抑制作用強(qiáng)于微米級(jí)的TiO2。將預(yù)先分別與納米TiO2作用的聚合酶、引物和模板加入到PCR體系中，聚合酶的上層清液、引物的沉淀、模板的上層清液與沉淀均有 DNA的合成，但合成量均小于納米TiO2直接加入PCR的DNA的合成量。他們認(rèn)為在避光下，銳鈦礦型納米TiO2抑制DNA合成的主要原因是納米TiO2具有高的比表面積，對(duì)聚合酶、引物和模板存在較強(qiáng)的吸附作用， 對(duì)引物的吸附作用最強(qiáng)，對(duì)聚合酶的吸附最弱。

3 總結(jié)與展望

將納米材料引入到聚合酶鏈反應(yīng)中，可以同時(shí)發(fā)揮納米材料和DNA的優(yōu)點(diǎn)，極大地拓寬PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。將納米材料用于PCR體系中，提高了PCR的特異性，增加了產(chǎn)量；拓寬了PCR的退火溫度范圍，使PCR在低至25 ℃時(shí)也能退火；有利于小片段DNA的擴(kuò)增；可以代替緩沖液中Mg2＋的作用。

預(yù)計(jì)今后的相關(guān)研究將會(huì)側(cè)重于以下幾個(gè)方面：（1） 尋找有利于大片段DNA擴(kuò)增的納米材料。目前研究發(fā)現(xiàn)納米金對(duì)PCR的促進(jìn)作用是更有利于小片段DNA（1 kb以下）的擴(kuò)增。而在實(shí)際應(yīng)用中，大片段DNA的擴(kuò)增非常重要?，F(xiàn)在基因克隆研究中，長(zhǎng)片段以及超長(zhǎng)片段DNA（10 kb以上）的擴(kuò)增還不能取得滿意的效果，主要原因是酶在PCR較高的變性溫度下（94 ℃）長(zhǎng)時(shí)間的工作，會(huì)出現(xiàn)活性降低甚至失活，因此研究納米材料對(duì)PCR變性溫度的影響具有重要意義。通過(guò)納米材料來(lái)降低PCR的變性溫度或者增強(qiáng)聚合酶的耐高溫性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段擴(kuò)增的理想效果，是今后的一個(gè)研究方向；（2） 尋找新的納米材料來(lái)實(shí)現(xiàn)聚合酶的可控定量供應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)有一整套參與反應(yīng)的分子數(shù)量的定量控制體系，尤其是各種生物酶。而在PCR中，模板呈指數(shù)增長(zhǎng)，對(duì)各反應(yīng)組分尤其是聚合酶的需求也在變化，聚合酶不足會(huì)降低DNA的合成量，過(guò)量又易引發(fā)非特異擴(kuò)增。通過(guò)納米材料來(lái)調(diào)控PCR過(guò)程中聚合酶的量，將有望解決現(xiàn)在PCR技術(shù)中存在的若干問(wèn)題；（3） 使用人工納米材料將聚合酶和PCR的其它各反應(yīng)成分連接起來(lái)，使其充分接觸反應(yīng)，從而提高PCR反應(yīng)效率；（4）根據(jù)PCR體系各種抑制劑的作用機(jī)制的不同，引入表面修飾有各種官能團(tuán)的人工納米材料，與各種抑制劑反應(yīng)，消除其對(duì)PCR體系的負(fù)面影響。

3 總結(jié)與展望

將納米材料引入到聚合酶鏈反應(yīng)中，可以同時(shí)發(fā)揮納米材料和DNA的優(yōu)點(diǎn)，極大地拓寬PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。將納米材料用于PCR體系中，提高了PCR的特異性，增加了產(chǎn)量；拓寬了PCR的退火溫度范圍，使PCR在低至25 ℃時(shí)也能退火；有利于小片段DNA的擴(kuò)增；可以代替緩沖液中Mg2＋的作用。

預(yù)計(jì)今后的相關(guān)研究將會(huì)側(cè)重于以下幾個(gè)方面：（1） 尋找有利于大片段DNA擴(kuò)增的納米材料。目前研究發(fā)現(xiàn)納米金對(duì)PCR的促進(jìn)作用是更有利于小片段DNA（1 kb以下）的擴(kuò)增。而在實(shí)際應(yīng)用中，大片段DNA的擴(kuò)增非常重要。現(xiàn)在基因克隆研究中，長(zhǎng)片段以及超長(zhǎng)片段DNA（10 kb以上）的擴(kuò)增還不能取得滿意的效果，主要原因是酶在PCR較高的變性溫度下（94 ℃）長(zhǎng)時(shí)間的工作，會(huì)出現(xiàn)活性降低甚至失活，因此研究納米材料對(duì)PCR變性溫度的影響具有重要意義。通過(guò)納米材料來(lái)降低PCR的變性溫度或者增強(qiáng)聚合酶的耐高溫性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段擴(kuò)增的理想效果，是今后的一個(gè)研究方向；（2） 尋找新的納米材料來(lái)實(shí)現(xiàn)聚合酶的可控定量供應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)有一整套參與反應(yīng)的分子數(shù)量的定量控制體系，尤其是各種生物酶。而在PCR中，模板呈指數(shù)增長(zhǎng)，對(duì)各反應(yīng)組分尤其是聚合酶的需求也在變化，聚合酶不足會(huì)降低DNA的合成量，過(guò)量又易引發(fā)非特異擴(kuò)增。通過(guò)納米材料來(lái)調(diào)控PCR過(guò)程中聚合酶的量，將有望解決現(xiàn)在PCR技術(shù)中存在的若干問(wèn)題；（3） 使用人工納米材料將聚合酶和PCR的其它各反應(yīng)成分連接起來(lái)，使其充分接觸反應(yīng)，從而提高PCR反應(yīng)效率；（4）根據(jù)PCR體系各種抑制劑的作用機(jī)制的不同，引入表面修飾有各種官能團(tuán)的人工納米材料，與各種抑制劑反應(yīng)，消除其對(duì)PCR體系的負(fù)面影響。