【摘要】 研究新型納米仿生骨植入材料的生物相容性。 【方法】 采用骨髓基質細胞體外培養技術，通過ＭＴＴ法檢測細胞相對增殖度，對材料的細胞毒性進行分級評價，并采用直接接觸培養法，觀察細胞在材料上的黏附與散布。 【結果】 材料的細胞毒性分級在０～１之間，骨髓基質細胞可緊密附著于材料表面，黏附生長，并有突起向材料的連通微孔內伸展。【結論】 新型納米仿生骨植入材料對骨髓基質細胞無毒性作用，符合醫用生物材料的安全要求。

【關鍵詞】 仿生 復合材料 骨髓基質細胞 浸提液 生物相容性

Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｎｉｃ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｗｉｔｈ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ

Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｗｉｔｈ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａ ｃｅｌｌｓ （ＭＳＣ） ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ． Ｃｅｌｌ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ （ＲＧＲ） ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ａｄｈｅｒｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ＭＳＣｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｍｅｎ， ｕｓｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｔａｃｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ， ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＳＥＭ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｒａｎｋｅｄ ｆｒｏｍ ｇｒａｄｅ ０ ｔｏ ｇｒａｄｅ １． ＭＳＣｓ ａｔｔａｃｈｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ａｄｈｅｒｅｄ ｆｉｒｍｌｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ． Ｏｂｖｉｏｕｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｉｅｓ ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ-ｐｏｒｅｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｈａｖｅ ｎｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ ＭＳＣｓ ａｎｄ ａｃｃｏｒｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂｉｏｎｉｃ； ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ； ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ； ｅｘｔｒａｃｔ ｌｉｑｕｉｄ； ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ

新型生物材料的生物相容性是影響其臨床應用的主要因素，材料的孔徑形狀、大小以及孔隙率對引導細胞的附著、侵潤和生長有著重要的作用［１， ２］，由于本實驗材料需要植入體內與骨組織緊密接觸，因此材料的骨細胞相容性是本研究的主要內容。本實驗采用骨髓基質細胞的體外培養技術對新研制的新型納米仿生骨植入材料（ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ）進行了初步評價，為今后進一步的研究提供實驗依據。

１ 材料和方法

１．１ 材料與儀器

新型納米仿生骨植入材料：３-羥基丁酸-ｃｏ-３-羥基戊酸共聚物／溶膠-凝膠生物活性玻璃 ［ｐｏｌｙ（３-ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ-ｃｏ-３-ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）／ ｓｏｌ ｇｅｌ ｂｉｏａｃｔｉｖｅｇｌａｓｓ，ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ］（華南理工大學材料學研究所提供）。

主要儀器和設備：醫用超凈工作臺、ＣＯ２培養箱、臺式離心機、酶聯免疫檢測儀、倒置相差顯微鏡（中山三院中心實驗室提供）；ＸＬ-３０／ＤＸ-４Ｉ掃描電鏡／能譜分析儀（ＰＨＬＩＰＳ）（信息產業部電子五所國防科技重點實驗室提供）。

主要試劑和材料：ＤＭＥＭ培養液（Ｇｂｉｃｏ）、胎牛血清（Ｓｉｇｍａ）、胰蛋白酶（ＰＡＡ）、ＭＴＴ（Ｇｂｉｃｏ）等（購自晶美生物制品公司）。

１．２ 實驗方法

１．２．１ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料的掃描電鏡觀察 常規干燥、表面噴金，進行ＳＥＭ檢查，直接觀察材料的結構、多孔形態、孔徑和孔的貫通性。

１．２．２ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料的孔隙率測定

采用常規稱量法［３］，計算材料的孔隙率。

１．２．３ 骨髓基質細胞的原代培養及傳代

采用全骨髓培養法（直接貼壁法）進行原代培養，取傳代生長良好的２ ～ ４代細胞制作細胞生長曲線。

１．２．４ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料浸提液的制備

ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料用環氧乙烷消毒備用，確定材料浸提液的標準濃度為培養液與材料表面積之比：１０ ｍＬ／ｃｍ２，將支架材料浸入完全培養液中，標準條件下（３７ ℃，５％ ＣＯ２，飽和濕度）的培養箱中浸提２ ～ ３ ｄ，吸出浸提液，無菌封存，４ ℃保存備用。同樣方法制備８倍、４倍、２倍、１倍、０．５倍、０．２５倍標準濃度的浸提液。

１．２．５ ＭＴＴ法評價材料的毒性分級

根據已繪制的細胞生長曲線，確定本實驗的細胞接種濃度和接種的細胞數量，測定不同浸提液濃度分組的細胞相對增殖率（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ，ＲＧＲ），按５級毒性分級法評分：０級ＲＧＲ≥１００％；１級ＲＧＲ≥８０％；２級ＲＧＲ≥５０％；３級ＲＧＲ≥３０％；４級ＲＧＲ≥０。

１．２．６ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料的細胞相容性

將ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料用高糖ＤＭＥＭ完全培養基浸泡３ ｄ，使用前用無菌濾紙吸干，置于２４孔板中。取生長狀態良好的第２ ～ ４代培養細胞，調整細胞濃度為５ × １０５／ｍＬ，滴加于材料表面接種于支架材料上，每塊材料上接種細胞液２００ ?滋Ｌ，靜置３ ｈ后加入培養基至浸沒材料。２ ～ ３ ｄ常規換液一次，分別于１ ｄ、３ ｄ、６ ｄ將細胞-材料復合物用２０ ｇ／Ｌ或體積分數為３％戊二醛固定，乙醇逐級脫水，乙酸異內酯置換，臨界點干燥，表面噴金后掃描電鏡觀察。

２ 結 果

２．１ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料的結構

ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料呈白色，略有彈性，表面為泡沫多孔狀結構（圖１），掃描電鏡下見材料為疏松多孔結構，孔隙多并相互聯通，孔隙大小約１００ ～ ３００ ?滋ｍ，其中可見納米級的ＳＧＢＧ顆粒鑲嵌或包裹在ＰＨＢＶ基體孔壁上（圖２）。

２．２ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料的孔隙率 材料孔隙率的檢測結果顯示：ε＞ ９０％

２．３ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料的細胞毒性實驗

根據培養細胞的生長標準曲線，本研究ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料浸提液進行ＭＴＴ細胞毒性分析的實驗分別在１ ｄ、３ ｄ、５ ｄ分三次進行，在細胞培養的開始、進入快速增殖期、以及細胞數量達到極限值之前的三個時間段完成檢測。結果見表１，可見各濃度組不同時期的毒性分級均在０～１級之間。 ＳＰＳＳ１１．５統計軟件分析研究結果顯示：隨著材料浸提液濃度的增高，ＯＤ值略有下降，但該變化并不具有顯著性差異（Ｐ ＞ ０．０５）；高濃度的材料浸提液對細胞生長的影響與低濃度相比并不存在顯著性差異（Ｐ ＞ ０．０５）；隨著培養時間的延長各實驗組細胞數量都明顯增加，１ ｄ、３ ｄ、５ ｄ三個測試時間點上，各濃度組細胞增殖數ＯＤ值與對照組相比無明顯差異 （Ｐ ＞ ０．０５）。不同濃度材料浸提液組，在１、３、５天時檢測的ＯＤ值變化曲線圖顯示：各濃度組的ＯＤ值變化與對照組幾乎完全重疊。

２．４ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料中細胞黏附和生長形態的觀察

細胞培養第１天，可見骨髓基質細胞在ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料表面緊密貼壁生長，呈長梭形或有長突起的扁平多角形，突觸舒展明顯，相鄰細胞胞體相連，并向材料孔隙中伸延（圖３Ａ）；細胞培養第３天，可見大量骨髓基質細胞在ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料表面黏附、增殖，胞體呈梭形、多角形，細胞生長密集的地方可見細胞堆積復層生長（圖３Ｂ）；細胞培養第６天，仍可見骨髓基質細胞在ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料表面黏附、生長，細胞呈不規則形（圖３Ｃ）。

３ 討 論

３．１ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ充填材料的多孔結構與骨的生長

骨再生具有三個基本機制，即骨誘導、骨傳導和骨生成。骨傳導是指宿主骨床周圍的毛細血管和骨祖細胞、成軟骨細胞和成骨細胞長入骨缺損區，而植入材料則逐漸被宿主新骨組織替代的過程。研究發現具有類似自然骨的連通微孔結構的材料，可以支持和引導新生骨組織通過互相連通的孔道向材料的叢深生長，為骨組織的再生提供理想的支架結構［４］。孔徑、孔隙率以及孔的連通性是評價材料空間結構的幾個重要的指標。

本研究采用的ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料為疏松多孔結構，孔徑大小為１００ ～ ３００ μｍ，孔隙率 ＞ ９０％。孔隙多且孔孔之間互相連通，有助于新骨組織從材料表面長入內部和血液流通。同時大量的微孔以及較大的比表面積，不僅可使材料體積小，易降解，同時又能獲得足夠的機械強度，以滿足臨床治療的需要。

３．２ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料的ＭＴＴ毒性分析

材料的細胞毒性是評價生物材料與細胞之間相互作用的最重要的指標，而細胞相對增殖度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ， ＲＧＲ）則是材料細胞毒性評估中的一個重要參數［５］。本研究采用ＭＴＴ法來計算細胞ＲＧＲ，并將細胞相對增殖率換算成毒性分級１－５級，來評估實驗材料的細胞毒性［６］。研究結果顯示隨著材料浸提液濃度的增高，ＯＤ值有所下降，但該變化并不具有顯著性差異（Ｐ ＞ ０．０５），說明該材料浸提液濃度的提高并不抑制細胞的生長、增殖；隨著培養時間的延長，各實驗組細胞數量都明顯增加，在１ｄ、３ｄ、５ｄ三個測試時間點上，各濃度組細胞增殖數ＯＤ值與對照組幾乎完全重疊，高濃度組的材料浸提液對細胞生長的影響與低濃度組相比并不存在顯著性差異（Ｐ ＞ ０．０５），說明該材料浸提液的細胞毒性并未出現濃度依賴性，即使是高濃度的材料浸提液在細胞培養的開始、進入快速增殖期、以及細胞數量達到極限值之前的三個具代表性的時間段，都是安全、無毒的；倒置顯微鏡下可見各組各個時期的細胞呈梭形，伸展充分，形態良好，細胞密度高，生長旺盛，可見大量分裂細胞，與對照組相比，無顯著性差異，說明各濃度組的細胞生長良好；各濃度組不同時期的毒性分級均在０～１級之間，說明該材料對骨髓基質細胞無細胞毒性作用，符合生物材料的醫用標準。 本研究的ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料共制備了終濃度為８倍、４倍、２倍、１倍、０．５倍、０．２５倍、０．１２５倍標準濃度的７種浸提液，較全面地探討了該材料浸提液的細胞毒性。同時本研究根據材料植入體內部位和使用目的的要求，選擇骨髓基質細胞作為體外培養的實驗細胞，更好地模擬出了植入材料在體內骨組織中的真實情況，準確地反映出實驗材料的細胞毒性及其與骨髓基質細胞間的相互作用。

３．３ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料的細胞相容性

觀察植入材料與細胞之間的相互作用是研究植入材料細胞相容性的重要內容，采用直接接觸的細胞培養法，可以直接觀察到細胞在材料表面貼附的情況，一旦材料中有毒性物質釋放時，細胞的形態、數量和增殖狀態會立即發生變化，為材料的細胞相容性提供最直觀的證據，其評價結果客觀、敏感和有效［７］。本研究結果顯示：骨髓基質細胞能緊密附著于ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料表面，貼附生長，并有突起向材料的連通微孔內伸展，增殖狀態良好，結果證實該材料具有優良的細胞親和性，這可能與材料的結構有關。由于ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料具有泡沫多孔狀結構，具有大小合適的孔徑、較高的孔隙率和類似自然骨的連通微孔結構，利于骨髓基質細胞的粘附生長、營養物質的滲入和廢物的排出，并促進其在材料上的遷移、分化和增殖。

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