細(xì)胞培養(yǎng)法檢測材料生物相容性是一種快速、簡便、重復(fù)性好又價(jià)廉的方法，在材料生物相容性評價(jià)中起著越來越重要的作用。由于新材料不斷涌現(xiàn)、材料植入體內(nèi)的部位及使用目的日趨繁雜、材料毒性作用的強(qiáng)弱以及與機(jī)體反應(yīng)的復(fù)雜性等因素決定了細(xì)胞毒性試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的多樣性。根據(jù)生物材料本身的理化特性、植入體內(nèi)的部位及使用目的選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)細(xì)胞至關(guān)重要。以往對材料生物相容性的評價(jià)往往著眼于細(xì)胞的形態(tài)與數(shù)量的變化，近幾年來研究材料對細(xì)胞生長、附著、增殖及代謝方面影響的報(bào)道日趨增多，并提出了以有活力的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞生長作為材料生物相容性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的觀點(diǎn)。通過結(jié)合免疫、化學(xué)、放射及影像學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)發(fā)展，使人們進(jìn)一步深入了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化關(guān)系，進(jìn)而闡明材料對細(xì)胞的作用機(jī)制，是今后細(xì)胞培養(yǎng)法評價(jià)材料生物相容性的發(fā)展方向。

Abstract It is quick convient good-repeating and cheap that examining the biotic materials compatibility through cell-culturing method，and it is more and more important in evaluating the compatibility of biotic material.The new material appeating continously complicating of the part and aim material be planted in the intensity of materials toxic effect the reactions complication of material and biotic body，all of these decide the variety of experiment method and cells in cell toxicity experiment.It is very important that choices the right experiment method and cells according to the materials character the part and aim the material be planted in .The evaluation of biotic materials compatibility stressed on the changing of cells form and quantity before.Inrecent years，more and more reports appear about material influeances the growth.adhesion proliferation and metabolizing of cell.and presents the point that the evaluation standard of biotic materials compatibility should be set according to the active cells quantity and their growth.Combining many subjects technological development，such as immunology， chemistry，radiation and shadowgraphy，thoroughly inquires the changeing relation of cells structure and funtion，furtherly clarifes the materials effect on cell，It is the developing direction in the future that evaluates the biotic materials compatibility in cedd-culturing method.

Key words Biotic material Cell-culturing Compatibility Toxicity experiment

生物材料的臨床應(yīng)用已有較長的歷史，廣泛應(yīng)用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科領(lǐng)域。目前美每年有2-3百萬人工臟器或假肢植入人體中。生物材料不僅要具有臨床使用時(shí)所需要的理化性能，還必須具有良好的生物相容性，以保證使用安全。如何快速準(zhǔn)確地評價(jià)材料的生物相容性，對于研制新材料和縮短研究周期起著重要的作用[1]。

根據(jù)1982年美國國家標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)和牙科協(xié)會(huì)（ANSI/ADA）公布的評價(jià)生物相容性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)草案，評價(jià)生物相容性的實(shí)驗(yàn)方法有全身毒性試驗(yàn)（口服法）、急性全身毒性試驗(yàn)（靜脈注射法）、吸入毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、皮下植入試驗(yàn)、骨內(nèi)植入試驗(yàn)、過敏試驗(yàn)等[2]。細(xì)胞培養(yǎng)法作為檢測材料毒性的手段（亦稱為細(xì)胞毒性試驗(yàn)），具有簡便、敏感性高、節(jié)省動(dòng)物、節(jié)約經(jīng)費(fèi)、縮短生物材料研究周期等優(yōu)點(diǎn)，正日益受到人們的廣泛重視。本文就該研究領(lǐng)域近幾年的發(fā)展及動(dòng)向作一簡介。

1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法的進(jìn)展

1948年Rosen Bluth等首次報(bào)道利用鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)來篩選聚合物，開始了細(xì)胞毒性試驗(yàn)評價(jià)生物材料的生物相容性的研究與應(yīng)用工作，迄今為止這方面已有大量的工作積累與研究發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)在評價(jià)材料生物相容性地位已得到公認(rèn)[3]。由于目前對生物相容性概念及機(jī)理還完全了解，加之材料的多樣性、置入要體內(nèi)環(huán)境中的變異性、材料與機(jī)體作用的復(fù)雜性等因素，故迄今為止，國內(nèi)外還沒有一個(gè)統(tǒng)一細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)由于細(xì)胞培養(yǎng)方式（如單層細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞懸液與材料混合培養(yǎng)、細(xì)胞在材料上培養(yǎng)等）的不同，細(xì)胞與材料之間有無間質(zhì)（即細(xì)胞直接與材料或其浸出液接觸，還是通過間質(zhì)接觸）以及材料毒性成份（即材料本身、浸出物、擴(kuò)散物或材料降解產(chǎn)物等）不同決定了細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法的多樣性。根據(jù)細(xì)胞和材料之間有無間質(zhì)可以將細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法分為間接法與直接法兩大類。

1.1間接法

最典型的間接法是瓊脂覆蓋法，該法是Dubecco在1952年首先提出[4]。其方法是將含有培養(yǎng)液的瓊層平鋪在有單層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，再在固化的瓊脂層上放上試樣進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。此法優(yōu)點(diǎn)是不管試驗(yàn)材料是什么形態(tài)（膜、粉末或油脂狀）等都適用。但該法敏感性受試樣溶出物瓊脂層上擴(kuò)散程度的影響。當(dāng)溶出物分子量小，易溶于水，其毒性發(fā)現(xiàn)早且較強(qiáng)。反之即使有毒的材料，如溶出物分子量大并難溶于水，使用該法時(shí)材料毒性就難以表現(xiàn)出來。

為克服瓊脂法的缺點(diǎn)，Sabita Sriva等提出分子濾過法[3]。該法是在單層細(xì)胞上覆蓋一層丙烯鹽制成的微孔濾膜，將試樣材料放在濾膜上，使材料毒性在成份通過濾膜作用于其下的細(xì)胞。由于濾膜微孔直徑約0.45μm，Bondemark認(rèn)為該法適合評價(jià)毒性成份分子量小的材料的相容性[5]。 van Luyn等1992年報(bào)道用甲基纖維素細(xì)胞培養(yǎng)法評價(jià)聚合物的細(xì)胞毒性[6]。該法是在甲基纖維素中混入細(xì)胞表面進(jìn)行培養(yǎng)。該法優(yōu)點(diǎn)是生物材料的水解及細(xì)胞壞死釋放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均要發(fā)生，因此可同觀察到生物材料的原發(fā)性及繼發(fā)性細(xì)胞毒性。

1.2 直接法

生物材料中一些易溶出物質(zhì)引起炎癥反應(yīng)和組織反應(yīng)的主要原因。易溶出物質(zhì)一般是原料單體、低分子聚合物、催化劑、溶劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等。為研究這些溶出物的細(xì)胞毒性，一些學(xué)者提出浸出液法。該法是將試樣投入培養(yǎng)液或蒸餾水中適當(dāng)條件下進(jìn)行浸泡，制備出含有溶出的浸泡液再將浸了液加在含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿或試管中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察溶出物對細(xì)胞的影響。Oshima認(rèn)為不同浸提條件和浸提方式所制備的材料溶出物在細(xì)胞敏感程度上并無顯著性差異[7]。

直接浸漬法：該法是形態(tài)不規(guī)則的試樣（如金屬粉末、油脂類材料）等與細(xì)胞一起放入培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)有溶出物時(shí)試樣周圍的細(xì)胞就會(huì)受到影響。寧淑華等1988年用該法對醫(yī)用硅膠及聚乙烯醇進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)[8]。作者認(rèn)為對于形態(tài)不規(guī)則有微量毒性的材料使用該法較為適宜。

另一些學(xué)者在直接法基礎(chǔ)上提出直接接觸法。該法將細(xì)胞直接放在生物材料上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)有毒性物質(zhì)釋放時(shí)，由細(xì)胞形態(tài)變化和數(shù)量增減檢測細(xì)胞毒性程度，同時(shí)可以直接觀察到細(xì)胞在材料表面貼附情況。直接接觸法不僅能直接檢測材料溶出物的細(xì)胞毒性，同時(shí)也是考察材料與組織細(xì)胞相容性的重要手段。通常“材料生物相容性好”，很多場合都是指細(xì)胞容易貼壁且能迅速繁殖生長。因此可根據(jù)直接接觸法細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果推測材料植入人體后與機(jī)體細(xì)胞的反應(yīng)。但是，對于與血液接觸的循環(huán)系統(tǒng)來說，為了避免引起血栓形成，就希望細(xì)胞難以貼壁且不易增殖。因此應(yīng)根據(jù)材料的使用目的，作出相應(yīng)的生物相容性判斷。

Tsuchiya[9]等于1994年對瓊脂法、分子濾過法、浸出液和直接接觸法對材料的細(xì)胞毒性敏感程度的差異性進(jìn)行比較。作者認(rèn)為浸出液法適合檢測材料溶出物毒性，并與動(dòng)物毒性試驗(yàn)結(jié)果相符合。直接接觸法對材料的細(xì)胞毒性敏感性最高，可測出材料微弱的細(xì)胞毒性。瓊脂法適合對毒性大的大指材料進(jìn)行篩選。分子濾過法適合毒性成份分子子量小的材料進(jìn)行生物相容性評價(jià)。

綜上所述。細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法多種多樣，并各有其特色。每種試驗(yàn)方法因其原理及方法不同，選擇材料的針對性也不同。根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料本身理化性質(zhì)、毒性成份表現(xiàn)形式、毒性作用強(qiáng)弱及材料用途選擇正確的實(shí)驗(yàn)方法是至關(guān)重要的。

2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究進(jìn)展

目前細(xì)胞毒性試驗(yàn)中應(yīng)用最早的及使用最廣泛的細(xì)胞是L-929細(xì)胞，該細(xì)胞是Earle等1948年從小鼠皮小組織中分離出的成纖維細(xì)胞。另一種應(yīng)用較多的細(xì)胞是Gey等1953年從人類子宮腫瘤中分離出的子宮粘膜上細(xì)胞（HeLa細(xì)胞）[10]。由于這兩種具有傳代容易，繁殖迅速、體外培養(yǎng)條件低、易儲(chǔ)存，同時(shí)這兩種已建立成系的細(xì)胞株能為實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定傳代的細(xì)胞，能為許多材料細(xì)胞毒性評價(jià)所共用等優(yōu)點(diǎn)。1982年美國質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)將L-929細(xì)胞和HaLe細(xì)胞推薦為細(xì)胞毒性試驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞[2]。

由于L-929細(xì)胞來源于小鼠的皮下組織，HaLe細(xì)胞來源于人的腫瘤組織。這兩種已建立成系的細(xì)胞株都具有無限分裂增殖類似腫瘤細(xì)胞的特征。因此人們對利用這現(xiàn)兩種細(xì)胞代替人體正常組織細(xì)胞評價(jià)材料的生物相容性的敏感性及可靠性產(chǎn)生了疑問。同時(shí)隨著不斷涌現(xiàn)，人們對材料植入人體后與機(jī)體組織之間可能發(fā)生的反應(yīng)其對材料的影響產(chǎn)生了濃厚的興趣。因此單用L0929和HaLe細(xì)胞培養(yǎng)檢測材料的生物相容性已不能滿足人們的這種需要。

從九十年代起越來越多學(xué)者根據(jù)材料植入體內(nèi)的不同部位及使用目的選擇人體不部位或/和組織來源的細(xì)胞作業(yè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，使體外細(xì)胞培養(yǎng)對機(jī)體內(nèi)環(huán)境的模擬更趨真實(shí)，其結(jié)果更為準(zhǔn)確與客觀。

對宿主而言植入宿主體內(nèi)的生物材料是種異物，因此材料植入體內(nèi)最普遍和最常見的反應(yīng)是免疫排斥反應(yīng)。由于單核巨噬細(xì)胞來源于人體的血液，在人體免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，能釋放各種刺激因子激活補(bǔ)體引起急慢性炎癥反應(yīng)，同時(shí)刺激成纖維細(xì)胞生長促進(jìn)傷品的愈合。因此選擇單核巨噬細(xì)胞作評價(jià)材料細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，有助于人們了解材料置入體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)對組織細(xì)胞的影響[1]。

Cheung認(rèn)為不同組織來源的細(xì)胞材料的敏感性是有差異的[12]。只用軟組織來源的細(xì)胞培養(yǎng)檢測材料的細(xì)胞毒性尚不能全面反映出材料的生物相容性。以骨替代材料和牙用材料為例。前者種植到骨組織內(nèi)，所接觸的是骨環(huán)境，而后者存在于軟組織環(huán)境中。因此骨替代材料應(yīng)選擇骨組織來源的細(xì)胞，因?yàn)檫@種細(xì)胞在體外培養(yǎng)中可形成體內(nèi)環(huán)境一致的礦物化小結(jié)，這種小結(jié)內(nèi)含有類成骨細(xì)胞和類骨髓細(xì)胞及鈣化的膠原基質(zhì)，使體外細(xì)胞包培養(yǎng)更好地模擬了生物材料與骨組織在體內(nèi)的反應(yīng)。牙用材料可釋放一些可溶性的毒性成份如Na+、Ca2+、Al3+和氟化物等[]14，這些可溶物質(zhì)主要影響鄰近的牙組織及口腔粘膜的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及各種免疫細(xì)胞，并對這些細(xì)胞的生長、附著增殖及代謝等功能產(chǎn)生影響。因此對牙材料采用口腔粘膜的成纖細(xì)胞或/和上皮細(xì)胞才能更準(zhǔn)確地反映出材料的生物相容性。

3 細(xì)胞毒性的觀察方法

以往對材料生物相容性的評價(jià)往往著眼于細(xì)胞的形態(tài)與數(shù)量，通過細(xì)胞形態(tài)的改變和數(shù)量的增減判斷材料的細(xì)胞毒性[15]。由于材料毒性成份對細(xì)胞的損傷，首先發(fā)生細(xì)胞生物化學(xué)反應(yīng)和生物分子結(jié)構(gòu)的改變，出現(xiàn)代謝和機(jī)能的改變?nèi)缇€粒體氧化代謝障礙、蛋白質(zhì)合成下降，細(xì)胞膜選擇性通透屏障作用消失等，這種變化用形態(tài)學(xué)方法通常不能發(fā)現(xiàn)。只有當(dāng)細(xì)胞死亡10h以上，細(xì)胞的自溶性變化相當(dāng)明顯的才能在光顯微鏡下根據(jù)細(xì)胞死亡的判斷特點(diǎn)，即核濃縮、核碎裂、胞漿伊紅染色等判斷材料的細(xì)胞毒性程度。因此傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性觀察方法不能及時(shí)、準(zhǔn)確地判斷材料的細(xì)胞毒性。

九十年代以來，越來越多學(xué)者傾向于從材料毒性成份引起細(xì)胞死亡所產(chǎn)生的細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化評價(jià)材料生物相容性轉(zhuǎn)移到材料對細(xì)胞的生長、附著、增殖及代謝功能的影響，并提出了以存活的有功能的細(xì)胞或/和細(xì)胞生長增殖情況作材料的生物相容性評價(jià)指標(biāo)。

在體外細(xì)胞培養(yǎng)中已有學(xué)者提出一些能敏感地反映細(xì)胞活力功/和細(xì)胞殖的實(shí)驗(yàn)室評價(jià)方法。如放射性位素（3H-胸腺嘧啶，3H-亮氨酸等）攝入法[16]、熒光染色法（如乙酰乙酸熒光素）[18]、流式細(xì)胞光度術(shù)等[19]。這此方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍。

放射性同位素?cái)z入法是在培養(yǎng)基中摻入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等，根據(jù)3H-胸腺嘧啶在細(xì)胞內(nèi)含量測量DNA的合成含量，3H-亮氨酸含量測定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成清況[16]。該法能揭示細(xì)胞分子水平的動(dòng)態(tài)變化，是研究細(xì)胞代謝狀態(tài)的重要手段。但同位素物質(zhì)對研究人員會(huì)造成一定程度的放射性損害，同時(shí)需要特殊設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)室和一些特殊設(shè)備是其缺點(diǎn)。

四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初應(yīng)用于免疫學(xué)領(lǐng)域，近年一些學(xué)者將該法應(yīng)用到生物相容性評價(jià)中[20]。其原理是線粒體琥珀酸脫氫酶能催化四甲基偶氮唑鹽（MTT）形成蘭色甲替。形成數(shù)目的多寡與活細(xì)胞數(shù)目和功能狀態(tài)呈正相關(guān)，該法簡便迅速、不接觸同位素、而敏感性同位素法接近。該法缺點(diǎn)是甲替有時(shí)易聚集成團(tuán)影響結(jié)果的難確性。

熒光染色法：其基本原理是當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜的選擇通透性屏障作用消失，利用乙酰乙酸熒光素和溴化乙錠快速進(jìn)出細(xì)胞膜受損的細(xì)胞特點(diǎn)。在熒光顯微鏡下迅速區(qū)分受損細(xì)胞[22]該法特點(diǎn)適合評價(jià)首先影響細(xì)胞膜功能的材料的生理相容性。

流式細(xì)胞光度術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是近幾年迅速發(fā)展起來的分析細(xì)胞的方法[22]。該法利用鞘流原理，使被熒光標(biāo)記的單個(gè)懸浮細(xì)胞排成單列，按重力方向流動(dòng)。細(xì)胞被激光照射后反射熒光，檢測器械可逐個(gè)結(jié)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定。FCM對細(xì)胞測定能力30-60萬個(gè)細(xì)胞/分鐘，同時(shí)可對細(xì)胞的核酸，蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞周期分布等八種量進(jìn)行測定。該法在材料的生物相容性評價(jià)中有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)束語

細(xì)胞培養(yǎng)法檢測材料生物相容性是一種快速、簡便、重復(fù)性好又價(jià)廉的方法，在材料生物相容性評價(jià)中起著越來越重要的作用。由于新材料不斷涌現(xiàn)、材料植入體內(nèi)的部位及使用目的止趨繁雜、材料毒性作用的強(qiáng)弱以及材料與機(jī)體反應(yīng)的復(fù)雜性等因素，決定了細(xì)胞毒性試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的多樣性。根據(jù)生物材料本峰的理化特性、植入體內(nèi)的部位及使用目的選擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法和細(xì)胞至關(guān)重要。以往對材料生物相容性的評價(jià)往往著眼于細(xì)胞的形態(tài)與數(shù)量變化，近幾年來研究材料對細(xì)胞生長、附著、增殖及代謝方面影響的報(bào)道日趨增多，并提出了以有活力的細(xì)胞數(shù)或/和細(xì)胞生長作為材料生物相容性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的觀點(diǎn)。通過結(jié)合免疫、化學(xué)、放射及影像學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)發(fā)展，使人們進(jìn)一步深入了解細(xì)胞和功能變化關(guān)系，進(jìn)而闡明材料對細(xì)胞的作用機(jī)制，是今后細(xì)胞培養(yǎng)法評價(jià)材料生物相容性的發(fā)展方向。