細胞培養法檢測材料生物相容性是一種快速、簡便、重復性好又價廉的方法，在材料生物相容性評價中起著越來越重要的作用。由于新材料不斷涌現、材料植入體內的部位及使用目的日趨繁雜、材料毒性作用的強弱以及與機體反應的復雜性等因素決定了細胞毒性試驗中實驗方法及實驗細胞的多樣性。根據生物材料本身的理化特性、植入體內的部位及使用目的選擇適當的實驗方法和實驗細胞至關重要。以往對材料生物相容性的評價往往著眼于細胞的形態與數量的變化，近幾年來研究材料對細胞生長、附著、增殖及代謝方面影響的報道日趨增多，并提出了以有活力的細胞數和細胞生長作為材料生物相容性評價標準的觀點。通過結合免疫、化學、放射及影像學等多學科的技術發展，使人們進一步深入了解細胞結構和功能的變化關系，進而闡明材料對細胞的作用機制，是今后細胞培養法評價材料生物相容性的發展方向。

Abstract It is quick convient good-repeating and cheap that examining the biotic materials compatibility through cell-culturing method，and it is more and more important in evaluating the compatibility of biotic material.The new material appeating continously complicating of the part and aim material be planted in the intensity of materials toxic effect the reactions complication of material and biotic body，all of these decide the variety of experiment method and cells in cell toxicity experiment.It is very important that choices the right experiment method and cells according to the materials character the part and aim the material be planted in .The evaluation of biotic materials compatibility stressed on the changing of cells form and quantity before.Inrecent years，more and more reports appear about material influeances the growth.adhesion proliferation and metabolizing of cell.and presents the point that the evaluation standard of biotic materials compatibility should be set according to the active cells quantity and their growth.Combining many subjects technological development，such as immunology， chemistry，radiation and shadowgraphy，thoroughly inquires the changeing relation of cells structure and funtion，furtherly clarifes the materials effect on cell，It is the developing direction in the future that evaluates the biotic materials compatibility in cedd-culturing method.

Key words Biotic material Cell-culturing Compatibility Toxicity experiment

生物材料的臨床應用已有較長的歷史，廣泛應用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科領域。目前美每年有2-3百萬人工臟器或假肢植入人體中。生物材料不僅要具有臨床使用時所需要的理化性能，還必須具有良好的生物相容性，以保證使用安全。如何快速準確地評價材料的生物相容性，對于研制新材料和縮短研究周期起著重要的作用[1]。

根據1982年美國國家標準學會和牙科協會（ANSI/ADA）公布的評價生物相容性實驗標準草案，評價生物相容性的實驗方法有全身毒性試驗（口服法）、急性全身毒性試驗（靜脈注射法）、吸入毒性試驗、溶血試驗、皮下植入試驗、骨內植入試驗、過敏試驗等[2]。細胞培養法作為檢測材料毒性的手段（亦稱為細胞毒性試驗），具有簡便、敏感性高、節省動物、節約經費、縮短生物材料研究周期等優點，正日益受到人們的廣泛重視。本文就該研究領域近幾年的發展及動向作一簡介。

1 細胞毒性試驗方法的進展

1948年Rosen Bluth等首次報道利用鼠成纖維細胞培養來篩選聚合物，開始了細胞毒性試驗評價生物材料的生物相容性的研究與應用工作，迄今為止這方面已有大量的工作積累與研究發現。細胞毒性試驗在評價材料生物相容性地位已得到公認[3]。由于目前對生物相容性概念及機理還完全了解，加之材料的多樣性、置入要體內環境中的變異性、材料與機體作用的復雜性等因素，故迄今為止，國內外還沒有一個統一細胞毒性試驗方法。

細胞毒性試驗由于細胞培養方式（如單層細胞培養、細胞懸液與材料混合培養、細胞在材料上培養等）的不同，細胞與材料之間有無間質（即細胞直接與材料或其浸出液接觸，還是通過間質接觸）以及材料毒性成份（即材料本身、浸出物、擴散物或材料降解產物等）不同決定了細胞毒性試驗方法的多樣性。根據細胞和材料之間有無間質可以將細胞毒性試驗方法分為間接法與直接法兩大類。

1.1間接法

最典型的間接法是瓊脂覆蓋法，該法是Dubecco在1952年首先提出[4]。其方法是將含有培養液的瓊層平鋪在有單層細胞的培養皿中，再在固化的瓊脂層上放上試樣進行細胞培養。此法優點是不管試驗材料是什么形態（膜、粉末或油脂狀）等都適用。但該法敏感性受試樣溶出物瓊脂層上擴散程度的影響。當溶出物分子量小，易溶于水，其毒性發現早且較強。反之即使有毒的材料，如溶出物分子量大并難溶于水，使用該法時材料毒性就難以表現出來。

為克服瓊脂法的缺點，Sabita Sriva等提出分子濾過法[3]。該法是在單層細胞上覆蓋一層丙烯鹽制成的微孔濾膜，將試樣材料放在濾膜上，使材料毒性在成份通過濾膜作用于其下的細胞。由于濾膜微孔直徑約0.45μm，Bondemark認為該法適合評價毒性成份分子量小的材料的相容性[5]。 van Luyn等1992年報道用甲基纖維素細胞培養法評價聚合物的細胞毒性[6]。該法是在甲基纖維素中混入細胞表面進行培養。該法優點是生物材料的水解及細胞壞死釋放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均要發生，因此可同觀察到生物材料的原發性及繼發性細胞毒性。

1.2 直接法

生物材料中一些易溶出物質引起炎癥反應和組織反應的主要原因。易溶出物質一般是原料單體、低分子聚合物、催化劑、溶劑、穩定劑、乳化劑等。為研究這些溶出物的細胞毒性，一些學者提出浸出液法。該法是將試樣投入培養液或蒸餾水中適當條件下進行浸泡，制備出含有溶出的浸泡液再將浸了液加在含有細胞的培養皿或試管中繼續培養，觀察溶出物對細胞的影響。Oshima認為不同浸提條件和浸提方式所制備的材料溶出物在細胞敏感程度上并無顯著性差異[7]。

直接浸漬法：該法是形態不規則的試樣（如金屬粉末、油脂類材料）等與細胞一起放入培養皿中進行培養。當有溶出物時試樣周圍的細胞就會受到影響。寧淑華等1988年用該法對醫用硅膠及聚乙烯醇進行細胞毒性試驗[8]。作者認為對于形態不規則有微量毒性的材料使用該法較為適宜。

另一些學者在直接法基礎上提出直接接觸法。該法將細胞直接放在生物材料上進行細胞培養。當有毒性物質釋放時，由細胞形態變化和數量增減檢測細胞毒性程度，同時可以直接觀察到細胞在材料表面貼附情況。直接接觸法不僅能直接檢測材料溶出物的細胞毒性，同時也是考察材料與組織細胞相容性的重要手段。通?！安牧仙锵嗳菪院谩保芏鄨龊隙际侵讣毎菀踪N壁且能迅速繁殖生長。因此可根據直接接觸法細胞培養的結果推測材料植入人體后與機體細胞的反應。但是，對于與血液接觸的循環系統來說，為了避免引起血栓形成，就希望細胞難以貼壁且不易增殖。因此應根據材料的使用目的，作出相應的生物相容性判斷。

Tsuchiya[9]等于1994年對瓊脂法、分子濾過法、浸出液和直接接觸法對材料的細胞毒性敏感程度的差異性進行比較。作者認為浸出液法適合檢測材料溶出物毒性，并與動物毒性試驗結果相符合。直接接觸法對材料的細胞毒性敏感性最高，可測出材料微弱的細胞毒性。瓊脂法適合對毒性大的大指材料進行篩選。分子濾過法適合毒性成份分子子量小的材料進行生物相容性評價。

綜上所述。細胞毒性試驗方法多種多樣，并各有其特色。每種試驗方法因其原理及方法不同，選擇材料的針對性也不同。根據實驗材料本身理化性質、毒性成份表現形式、毒性作用強弱及材料用途選擇正確的實驗方法是至關重要的。

2 實驗細胞研究進展

目前細胞毒性試驗中應用最早的及使用最廣泛的細胞是L-929細胞，該細胞是Earle等1948年從小鼠皮小組織中分離出的成纖維細胞。另一種應用較多的細胞是Gey等1953年從人類子宮腫瘤中分離出的子宮粘膜上細胞（HeLa細胞）[10]。由于這兩種具有傳代容易，繁殖迅速、體外培養條件低、易儲存，同時這兩種已建立成系的細胞株能為實驗提供穩定傳代的細胞，能為許多材料細胞毒性評價所共用等優點。1982年美國質量標準協會將L-929細胞和HaLe細胞推薦為細胞毒性試驗中的標準細胞[2]。

由于L-929細胞來源于小鼠的皮下組織，HaLe細胞來源于人的腫瘤組織。這兩種已建立成系的細胞株都具有無限分裂增殖類似腫瘤細胞的特征。因此人們對利用這現兩種細胞代替人體正常組織細胞評價材料的生物相容性的敏感性及可靠性產生了疑問。同時隨著不斷涌現，人們對材料植入人體后與機體組織之間可能發生的反應其對材料的影響產生了濃厚的興趣。因此單用L0929和HaLe細胞培養檢測材料的生物相容性已不能滿足人們的這種需要。

從九十年代起越來越多學者根據材料植入體內的不同部位及使用目的選擇人體不部位或/和組織來源的細胞作業實驗細胞，使體外細胞培養對機體內環境的模擬更趨真實，其結果更為準確與客觀。

對宿主而言植入宿主體內的生物材料是種異物，因此材料植入體內最普遍和最常見的反應是免疫排斥反應。由于單核巨噬細胞來源于人體的血液，在人體免疫系統中起著重要的作用，能釋放各種刺激因子激活補體引起急慢性炎癥反應，同時刺激成纖維細胞生長促進傷品的愈合。因此選擇單核巨噬細胞作評價材料細胞毒性的實驗細胞，有助于人們了解材料置入體內引起的炎癥反應對組織細胞的影響[1]。

Cheung認為不同組織來源的細胞材料的敏感性是有差異的[12]。只用軟組織來源的細胞培養檢測材料的細胞毒性尚不能全面反映出材料的生物相容性。以骨替代材料和牙用材料為例。前者種植到骨組織內，所接觸的是骨環境，而后者存在于軟組織環境中。因此骨替代材料應選擇骨組織來源的細胞，因為這種細胞在體外培養中可形成體內環境一致的礦物化小結，這種小結內含有類成骨細胞和類骨髓細胞及鈣化的膠原基質，使體外細胞包培養更好地模擬了生物材料與骨組織在體內的反應。牙用材料可釋放一些可溶性的毒性成份如Na+、Ca2+、Al3+和氟化物等[]14，這些可溶物質主要影響鄰近的牙組織及口腔粘膜的上皮細胞、成纖維細胞及各種免疫細胞，并對這些細胞的生長、附著增殖及代謝等功能產生影響。因此對牙材料采用口腔粘膜的成纖細胞或/和上皮細胞才能更準確地反映出材料的生物相容性。

3 細胞毒性的觀察方法

以往對材料生物相容性的評價往往著眼于細胞的形態與數量，通過細胞形態的改變和數量的增減判斷材料的細胞毒性[15]。由于材料毒性成份對細胞的損傷，首先發生細胞生物化學反應和生物分子結構的改變，出現代謝和機能的改變如線粒體氧化代謝障礙、蛋白質合成下降，細胞膜選擇性通透屏障作用消失等，這種變化用形態學方法通常不能發現。只有當細胞死亡10h以上，細胞的自溶性變化相當明顯的才能在光顯微鏡下根據細胞死亡的判斷特點，即核濃縮、核碎裂、胞漿伊紅染色等判斷材料的細胞毒性程度。因此傳統的細胞毒性觀察方法不能及時、準確地判斷材料的細胞毒性。

九十年代以來，越來越多學者傾向于從材料毒性成份引起細胞死亡所產生的細胞形態和數量的變化評價材料生物相容性轉移到材料對細胞的生長、附著、增殖及代謝功能的影響，并提出了以存活的有功能的細胞或/和細胞生長增殖情況作材料的生物相容性評價指標。

在體外細胞培養中已有學者提出一些能敏感地反映細胞活力功/和細胞殖的實驗室評價方法。如放射性位素（3H-胸腺嘧啶，3H-亮氨酸等）攝入法[16]、熒光染色法（如乙酰乙酸熒光素）[18]、流式細胞光度術等[19]。這此方法各有其優缺點及適用范圍。

放射性同位素攝入法是在培養基中摻入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等，根據3H-胸腺嘧啶在細胞內含量測量DNA的合成含量，3H-亮氨酸含量測定細胞內蛋白質合成清況[16]。該法能揭示細胞分子水平的動態變化，是研究細胞代謝狀態的重要手段。但同位素物質對研究人員會造成一定程度的放射性損害，同時需要特殊設計的實驗室和一些特殊設備是其缺點。

四甲基偶氮唑鹽微量酶反應色法（MTT法）是由Mosroann在1983年提出，最初應用于免疫學領域，近年一些學者將該法應用到生物相容性評價中[20]。其原理是線粒體琥珀酸脫氫酶能催化四甲基偶氮唑鹽（MTT）形成蘭色甲替。形成數目的多寡與活細胞數目和功能狀態呈正相關，該法簡便迅速、不接觸同位素、而敏感性同位素法接近。該法缺點是甲替有時易聚集成團影響結果的難確性。

熒光染色法：其基本原理是當細胞受到損傷時，細胞膜的選擇通透性屏障作用消失，利用乙酰乙酸熒光素和溴化乙錠快速進出細胞膜受損的細胞特點。在熒光顯微鏡下迅速區分受損細胞[22]該法特點適合評價首先影響細胞膜功能的材料的生理相容性。

流式細胞光度術（Flow cytometry，FCM）是近幾年迅速發展起來的分析細胞的方法[22]。該法利用鞘流原理，使被熒光標記的單個懸浮細胞排成單列，按重力方向流動。細胞被激光照射后反射熒光，檢測器械可逐個結細胞的熒光強度進行測定。FCM對細胞測定能力30-60萬個細胞/分鐘，同時可對細胞的核酸，蛋白質、酶、細胞周期分布等八種量進行測定。該法在材料的生物相容性評價中有著廣泛的應用價值。

4 結束語

細胞培養法檢測材料生物相容性是一種快速、簡便、重復性好又價廉的方法，在材料生物相容性評價中起著越來越重要的作用。由于新材料不斷涌現、材料植入體內的部位及使用目的止趨繁雜、材料毒性作用的強弱以及材料與機體反應的復雜性等因素，決定了細胞毒性試驗中實驗方法及實驗細胞的多樣性。根據生物材料本峰的理化特性、植入體內的部位及使用目的選擇適當的實驗方法和細胞至關重要。以往對材料生物相容性的評價往往著眼于細胞的形態與數量變化，近幾年來研究材料對細胞生長、附著、增殖及代謝方面影響的報道日趨增多，并提出了以有活力的細胞數或/和細胞生長作為材料生物相容性評價標準的觀點。通過結合免疫、化學、放射及影像學等多學科的技術發展，使人們進一步深入了解細胞和功能變化關系，進而闡明材料對細胞的作用機制，是今后細胞培養法評價材料生物相容性的發展方向。