【摘要】 目的 制備適合新骨長(zhǎng)入的孔隙率、孔隙尺寸和結(jié)構(gòu)的多孔磷酸鈣組織工程支架材料。方法 通過(guò)濕法共沉淀法合成羥基磷灰石（HA）/磷酸三鈣（TCP）雙相粉末，采用有機(jī)泡沫浸漿法和適當(dāng)?shù)闹驴讋謩e制備多孔磷酸鈣陶瓷和多孔磷酸鈣骨水泥。采用掃描電鏡觀測(cè)試樣的孔隙結(jié)構(gòu)，測(cè)量其孔隙率，利用X射線衍射分析其相成分。結(jié)果 多孔磷酸鈣陶瓷和磷酸鈣骨水泥的孔隙率分別為72％和67％；孔隙尺寸分布在200μm和280μm左右；孔壁上分別存在大量孔徑為數(shù)微米至數(shù)十微米的微孔；X射線衍射結(jié)果證明多孔磷酸鈣陶瓷的組成包括HA和βTCP ，骨水泥的成分為HA，αTCP and βTCP。結(jié)論 試驗(yàn)制備的多孔磷酸鈣生物材料具有適合新骨長(zhǎng)入的孔隙直徑、孔隙率和良好的生物相容性。

【關(guān)鍵詞】 多孔磷酸鈣陶瓷; 骨水泥; 微孔; 生物相容性

Preparation and Characteration of Porous Calcium Phosphate Bioactive Material for Bone Tissue Engineering

【Abstract】 Objective To prepare the adaptive porous calcium phosphate bioactive material. Methods The hydroxyapatite/tricalcium phosphate biphasic powder was synthesized by the wet coprecipitation method. Then polymer sponge immersion method and appropriate progeny were used to prepare porous calcium phosphate (CaP) .The morphology and structure of CaP ceramics and CPC were observed by scanning electronic microscopy (SEM).Their phase composition were analyzed by Xray diffraction(XRD). Results The porosities of CaP ceramics and CPC were 72% and 67% respectively. Their pore sizes were 200 to 280 μm. The results of XRD showed that CaP ceramics composed of HA and βTcp， CPC composed of HA， βTCP. Conclusion The preparation by the experiment has appropriate pore size and porosity and excellent biocompatibility which are suitable to the bone ingrowth.

【Key words】 porous calcium phosphate (CaP) ceramics; cement; micropore; biocompatibility

1 前 言

磷酸鈣生物材料由于具有與自然骨組織相似的無(wú)機(jī)成分，因此表現(xiàn)出優(yōu)良的生物相容性，植入體內(nèi)后能夠與骨組織形成骨鍵合，被稱為生物或材料，并已經(jīng)成功地被應(yīng)用于臨床骨缺損的修復(fù)和填充［1］。但是，臨床常常會(huì)遇到病理情況下的骨缺損，如骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨缺損，患者的骨密度低，骨修復(fù)能力差；或者大體積的骨缺損。由于無(wú)機(jī)的磷酸鈣生物材料缺乏生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)等，引導(dǎo)新骨長(zhǎng)入磷酸鈣生物材料的能力有限，上述原因常常導(dǎo)致臨床不愈合或延遲愈合。因此，有研究提出通過(guò)體外培養(yǎng)細(xì)胞或在磷酸鈣生物材料中添加一定的生物因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白［2］（BMP），轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子［3］（TGFβ）等，或者在生物材料體外培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)添加生長(zhǎng)因子或細(xì)胞賦予生物材料誘導(dǎo)組織再生的能力［4］ ，有巨大的發(fā)展前景。因此，如何制備模仿自然骨組織的孔隙結(jié)構(gòu)，尤其是適合細(xì)胞長(zhǎng)入的孔隙結(jié)構(gòu)，包括適當(dāng)?shù)目紫冻叽纭⒁约翱紫兜呢炌ㄐ缘龋钱?dāng)前骨組織工程研究的熱點(diǎn)［5］。

2 材料制備和方法

2.1 雙相磷酸鈣粉末合成

本研究采用Ca(NO3)2和(NH4)2HPO4作為起始原料濕法合成混合均勻的羥基磷灰石（hydroxyapatite， HA）/磷酸三鈣(Tricalcium Phosphate， TCP)。通過(guò)控制反應(yīng)液中的pH值和Ca/P原子比可以制備不同HA/βTCP比例的共沉淀粉體。化學(xué)反應(yīng)方程式如下：

Ca(NO3)2+(NH4)2HPO4+NH4OH→ Ca5(OH)(PO4)3↓+ Ca3(PO4)2↓＋NH4NO3（式－1）

經(jīng)老化，將沉淀過(guò)濾并用蒸餾水反復(fù)清洗至pH 7，烘干，球磨機(jī)研磨成粉末備用。

2.2 磷酸鈣多孔支架的制備

磷酸鈣陶瓷多孔支架材料采用有機(jī)泡沫浸漿法，將上述合成的磷酸鈣粉料加入蒸餾水調(diào)制成磷酸鈣漿料，浸漬有機(jī)泡沫，干燥，然后經(jīng)過(guò)1 250℃的高溫?zé)Y(jié)，去除有機(jī)泡沫，即可制備多孔磷酸鈣陶瓷。

根據(jù)文獻(xiàn)［6］，多孔磷酸鈣骨水泥粉末由αTCP（αCa3(PO4)2）、DCPD（CaHPO4.2H2O）、HA（Ca5(PO4)3OH）、CaCO3按58∶25∶8.5∶8.5的質(zhì)量比混合而成。采用NaCl顆粒作為致孔劑，致孔劑占70 wt ％，其中60％的致孔劑的粒徑小于200 μm，剩下的40％分布在200～450 μm之間。采用磷酸緩沖液作為液相，將粉相和液相混合后，磷酸鈣骨水泥發(fā)生固化。在蒸餾水中將易溶造孔劑溶解，即形成多孔磷酸鈣骨水泥。

2.3 磷酸鈣多孔組織工程多孔材料的表征

2.3.1 孔隙率的測(cè)定 本研究采用直接稱重體積計(jì)算法測(cè)定多孔磷酸鈣陶瓷的孔隙率。先切取形狀規(guī)則且大小合適的多孔材料樣品，注意切割試樣時(shí)盡量不要使材料的原始孔隙結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變形，且試樣形狀應(yīng)便于測(cè)量和進(jìn)行體積計(jì)算。利用天平稱出試樣質(zhì)量，利用游標(biāo)卡尺進(jìn)行樣品的尺寸測(cè)量，并計(jì)算其體積，根據(jù)公式得出孔率［7，8］。

本實(shí)驗(yàn)中制備的骨水泥樣品，每個(gè)質(zhì)量都為1g。凝固后形狀為圓柱狀，測(cè)得直徑為15 mm，高3 mm.本實(shí)驗(yàn)采用的NaCl的密度為2.16 g/cm3.

2.3.2 形貌觀察 采用掃描電鏡觀察了組織工程多孔支架材料的高倍形貌。分別取兩種多孔磷酸鈣生物材料，鍍金，利用掃描電鏡（FEI，Quta 200）觀察多孔磷酸鈣生物材料的孔隙結(jié)構(gòu)和形貌。

2.3.3 成分分析 采用X射線衍射測(cè)定兩種組織工程支架材料的相組成，測(cè)試條件采用X射線衍射儀（Philip，Xpert）對(duì)樣品粉末進(jìn)行分析，選擇銅靶在35 mA、45 kV的測(cè)試條件［9］。

3 結(jié)果

3.1 磷酸鈣多孔材料的孔隙率

多孔材料的孔率（又稱孔隙率或孔隙度），是指多孔體中孔隙所占體積與多孔體總體積之比，一般以百分?jǐn)?shù)來(lái)表示，該指標(biāo)是多孔材料中的最基本的參數(shù)之一，也是決定多孔材料的其它性能的關(guān)鍵因素。多孔材料的孔隙包括貫通孔、半通孔和閉合孔3種，這3種孔率的總和就是總孔率［10］。

本研究所制備多孔磷酸鈣陶瓷的孔隙率約為72％；多孔磷酸鈣骨水泥的孔隙率約為67％.

3.2 形貌觀察

采用掃描電鏡觀察了多孔磷酸鈣陶瓷和磷酸鈣骨水泥的形貌，如圖2所示。從圖中可以觀察到，在兩種多孔支架材料大孔的孔壁上均有大量孔徑在幾個(gè)至數(shù)十微米的微孔，尤其是磷酸鈣多孔陶瓷。

3.3 成分分析

X射線衍射結(jié)果如圖3所示。從圖中可分析磷酸鈣陶瓷中主要相成分為羥基磷灰石（HA），此外還含有少量的磷酸三鈣（βTCP）。磷酸鈣骨水泥粉末主要為磷酸三鈣，其中主要包括β相的磷酸三鈣（βTCP）和少量的β相磷酸三鈣（βTCP）。磷酸鈣粉相和液相混合固化后，主要成分為HA、βTCP和βTCP，經(jīng)過(guò)蒸餾水的浸泡后，其中的βTCP、βTCP的含量下降，尤其是βTCP的衍射峰基本消失，而HA的含量明顯增加［11］。

磷酸鈣骨水泥能夠自行硬化并轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石的原理基于不同磷酸鈣鹽在水中的溶解度的差異。由于在pH 4.2～11范圍內(nèi)，羥基磷灰石在水中的溶解度是最小的，因而在熱力學(xué)上是最穩(wěn)定的。其它磷酸鈣鹽在水中會(huì)向HA轉(zhuǎn)化，因此，本實(shí)驗(yàn)制備的磷酸鈣骨水泥隨著固化以及在蒸餾水中浸泡后，HA的含量明顯增加，而磷酸鈣骨水泥粉相中的αTCP等，溶解或轉(zhuǎn)化成HA。雖然自然骨中無(wú)機(jī)相主要為HA，但也有少量的TCP，因此HA、αTCP和βTCP三種磷酸鈣鹽均具有優(yōu)良的生物相容性，已成功地被應(yīng)用于臨床［12］。

4 討論

通過(guò)體外培養(yǎng)細(xì)胞或在磷酸鈣生物材料中添加一定的生物因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP），轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子（TGFβ）等，或者在生物材料體外培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)添加生長(zhǎng)因子或細(xì)胞賦予生物材料誘導(dǎo)組織再生的能力，這種在體外構(gòu)建組織的方法被稱為“組織工程”，是目前研究的方向［13］。根據(jù)ASTM標(biāo)準(zhǔn)其定義為：“在體內(nèi)和體外應(yīng)用科學(xué)原理和方法構(gòu)建組織工程醫(yī)療產(chǎn)品，用于醫(yī)學(xué)診斷和治療。各種原理和技術(shù)是工程學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基本的實(shí)踐和方法，例如：制造傳統(tǒng)醫(yī)療器械和生物制品的細(xì)胞、基因，或藥物治療，胚胎學(xué)或其他形式的發(fā)育學(xué)和生物學(xué)，外科修復(fù)方法和技術(shù)等。組織工程也可用于生產(chǎn)非人體用產(chǎn)品。”，根據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)，其定義為：“指制造一類醫(yī)療產(chǎn)品的技術(shù)和工藝，這類醫(yī)療產(chǎn)品中活組織或細(xì)胞應(yīng)能修復(fù)、改善或再生受者細(xì)胞、組織和器官和/或其結(jié)果和功能”。

組織工程的三大要素分別為：細(xì)胞、細(xì)胞生長(zhǎng)因子和細(xì)胞載體材料。由于分離的細(xì)胞自身不能形成組織，它們需要特殊的環(huán)境，通常包括細(xì)胞生長(zhǎng)臨時(shí)的支架材料。這種三維支架材料常常模擬其自然對(duì)應(yīng)物——體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，既起物理支架的作用，又是細(xì)胞在體外培養(yǎng)和后期植入的粘附物質(zhì)。運(yùn)用于骨組織工程的支架材料主要有無(wú)機(jī)材料和生物可吸收高分子材料或它們的復(fù)合物，無(wú)機(jī)材料主要包括羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、磷酸三鈣（Tricalcium phosphate， TCP）以及它們組成的雙相磷酸鈣材料等［14］。但如何制備模仿自然骨組織的孔隙結(jié)構(gòu)，尤其是適合細(xì)胞長(zhǎng)入的孔隙結(jié)構(gòu)，包括適當(dāng)?shù)目紫冻叽纭⒁约翱紫兜呢炌ㄐ缘龋钱?dāng)前骨組織工程研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

貫穿式多孔結(jié)構(gòu)有利于組織液的滲入，使組織液能夠進(jìn)入材料內(nèi)部，材料與組織液接觸面積增加，有利于材料的生物降解［15］。為了適應(yīng)新生骨組織長(zhǎng)入材料的要求，微孔的最小孔徑必須大于100μm，此時(shí)，骨細(xì)胞可以在孔內(nèi)生長(zhǎng)，有利于材料的血管彼此連通，以保證長(zhǎng)入材料深部的組織有營(yíng)養(yǎng)供給，同時(shí)種植體可以起到支架作用［16］。

作者采用有機(jī)泡沫浸漬法和加入致孔劑的方法，制備出多孔磷酸鈣陶瓷和磷酸鈣骨水泥，通過(guò)控制有機(jī)泡沫的孔隙率和孔隙結(jié)構(gòu)，以及致孔劑的加入量和尺寸，有效控制多孔磷酸鈣陶瓷和骨水泥中的孔隙率和孔隙尺寸，并分別采用掃描電鏡、X射線研究分析其表面形貌和孔隙結(jié)構(gòu)，測(cè)定磷酸鈣陶瓷和骨水泥的孔隙率，以及相成分，證實(shí)其有利于細(xì)胞和細(xì)胞生長(zhǎng)因子在體外構(gòu)建組織，是具有適合新骨長(zhǎng)入的孔隙率、孔隙尺寸和結(jié)構(gòu)的多孔磷酸鈣組織工程支架材料。

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