作者：劉林 許鐵 秦宏敏 韓會峰

【摘要】 目的 建立小鼠胚胎成骨細胞和超高分子聚乙烯（UHMWPE）顆粒的體外聯合培養的新模型，初步研究超高分子聚乙烯顆粒對成骨細胞活性和核心結合因子α1（Cbfα1）表達的影響。方法 分為空白對照組和UHMWPE顆粒干預組，2組常規培養小鼠胚胎成骨細胞，待細胞貼壁后裝滿培養基，UHMWPE顆粒干預組加入UHMWPE顆粒，封閉倒置培養瓶，顆粒漂浮至貼壁細胞層。 應用流式細胞技術分析各組細胞早期凋亡情況。分別在共培養的第3、5、7天檢測細胞Cbfα1在mRNA和蛋白水平上的表達情況。結果 封閉條件下小鼠胚胎成骨細胞正常生長可達10天；UHMWPE顆粒不影響細胞增殖活性，對細胞無明顯毒性作用；UHMWPE顆粒干預組的目的基因Cbfα1表達增強。結論 超高分子聚乙烯顆粒可以獨立、直接影響成骨細胞相關因子的分泌。 【關鍵詞】 成骨細胞；超高分子聚乙烯顆粒；核心結合因子α1 Abstract： Objective By establishing a new model to co-culture mouse embryo osteoblasts and ultra-high molecular weight polyethylene (UHMWPE) particles in vitro to study the effects of polyethylene on osteoblast activity and related factors′ expression involved in the mechanism of aseptic loosening of arthroprosthesis. Methods The experiment was carried out in a blank control group and a UHMWPE particle intervention group.In the two groups，the embryonic mouse osteoblasts were conventionally cultured， with the culture flask filled with fluid medium after the cells began adhering to the vessel walls， and the flasks inverted and sealed so that the polyethylene particles could contact the cells. After 3， 5 and 7 days of incubation， the expression of Cbfα1 was studied by using semi-quantitative RT-PCR and Western blotting techniques. Results Under closed condition， the cells could keep on normal growth for nearly 10 days. The expression of gene Cbfα1 was increased in the intervention group， compared with the control group. Conclusion UHMWPE particles do not affect the cell proliferation， but can direct independent impacts on the secretive activity of osteoblasts. Key words: osteoblast; UHMWPE particle; Cbfα1 目前，全球每年約有100萬關節假體植入，而關節10年失效率幾近10％［1-2］。研究顯示，磨損微粒引起假體周圍界膜的形成和溶骨現象是造成假體松動的主要原因［3］。參與反應的細胞包括單核巨噬細胞、成骨細胞、成纖維細胞等，這些細胞產生各種細胞因子促進破骨細胞破骨，抑制成骨細胞成骨。不同濃度的金屬、骨水泥和高分子聚乙烯顆粒等對原代成骨細胞［4］或成骨細胞系［5］無毒性作用，但可以刺激上述細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等各類促進骨質丟失的炎癥因子。 常規方法無法使超高分子聚乙烯（UHMWPE）顆粒接觸到細胞，本研究應用新的體外培養法直接將UHMWPE顆粒加入到小鼠胚胎成骨細胞培養體系中，觀察UHMWPE顆粒對成骨細胞增殖情況和骨相關基因核心結合因子α1（Cbfα1）表達的影響。Cbfα1 屬于runt結構域基因家族的轉錄因子，是細胞因子誘導成骨的共同的信號分子，小鼠兩條Cbfα1等位基因缺失后出現肢體短小、全部的骨組織缺損，證實沒有成骨細胞。有研究證明了Cbfα1除調節成骨細胞分化外，還控制出生后骨骼的形成和發育過程，在成骨細胞的分化和成熟中起重要作用［6-7］。 1 材料和方法 1.1 實驗儀器與材料 1.1.1 主要儀器 CO2孵箱(瑞士Heraeus公司) ，超凈工作臺(蘇州超凈設備廠)，離心機(EPPENDORF公司)，紫外分光光度計(日本島津公司) 。 1.1.2 主要材料 UHMWPE顆粒（中國礦業大學提供，顆粒形態不規則，直徑為1.33～98.7 μm），小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，DMEM、胰蛋白酶、PBS緩沖液、青霉素、鏈霉素等常規實驗耗材(南京基天)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（ACTGene），rnagents總RNA提取系統（Promega），RT - PCR檢測系統（Promega），Cbfα1（Santa Cruz公司），辣根過氧化物酶結合的二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）。 1.2 實驗方法 1.2.1 顆粒內毒素的處理 將獲得的UHMWPE顆粒溶于75％乙醇，室溫下震蕩洗浴4次，每次1 h，再用100％乙醇浸泡過夜，消毒后的顆粒放置7天以使殘余環氧乙烷消除，處理后的顆粒懸浮浸泡于培養基中4℃ 保存。 1.2.2 細胞常規培養 小鼠胚胎成骨細胞（中國科學院北京細胞生物所提供）常規培養于含10 %胎牛血清、100×103 U/L青霉素、100×103 U/L鏈霉素的DMEM培養液中（全培），培養條件為37 ℃，CO2 飽和度為5%，定期觀察細胞生長情況，每2天用0.25 %的胰酶消化，進行1∶4傳代培養。 1.2.3 倒置培養法 實驗分為空白對照組和UHMWPE顆粒干預組。待細胞貼壁后向瓶中加滿培養基，然后將不同濃度、不同粒徑的UHMWPE顆粒加入干預組瓶中并封蓋（空白對照組不加任何顆粒），將培養瓶翻轉倒置，使粉末貼于細胞生長層面。 1.2.4 應用流式細胞技術分析細胞凋亡情況 分別在第3、5天棄掉培養基并用PBS沖洗細胞表面的UHMWPE顆粒，用不含EDTA的胰酶消化細胞，時間不宜過長，加入1 ml冷的PBS液洗滌2次，1 000 g×10 min離心，棄上清液，調整待測細胞的密度為 5×105～1×106個/ml；將細胞重懸于500 μl Binding Buffer中，同時設立調零組。向每管加入20 μl Annexin V-FITC和5 μl溴化吡啶，輕輕混勻，室溫避光反應5 min，上機檢測。實驗操作重復3次。 1.2.5 總RNA的提取、RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳 分別在細胞培養的第3、5、7天棄掉UHMWPE顆粒和培養基，用PBS沖洗貼壁細胞，用0.25％的胰酶消化細胞，離心后按照RNA試劑盒說明提取總RNA，用1％的瓊脂糖進行總RNA電泳，并用無RNA酶水溶解，取出少量稀釋后，經紫外分光光度計測定其濃度和純度，根據測定值調整RNA 標本濃度為1 g/L。半定量檢測Cbfaα1和內參GAPDH 的mRNA的表達情況，RT-PCR 反應體系中加入2對引物（具體操作過程參照說明書）。擴增條件:Mg2+115 mmol/L（具體反應條件見表1）。 正常成骨細胞為陰性對照，所有的實驗組與對照組重復3次。PCR結束后經2%的瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后拍照，然后進行灰度分析（Image J圖像分析軟件）并繪制灰度值柱形圖。表1 Cbfα1、GAPDH RT-PCR反應條件 1.2.6 Western blotting分析 待融合率達到80%以上時參照Santa Cruz公司蛋白提取方法，應用RIPA 緩沖液裂解成骨細胞得到總蛋白。以牛血清蛋白(BSA) 作為標準品，根據蛋白定量試劑盒(美國Bio-Rad 公司) 說明繪制蛋白定量標準曲線，于分光光度計595 nm下測光密度值，計算提取液蛋白濃度。每一樣品取20 μg，以5∶1的體積與5×SDS加樣緩沖液混合，100℃加熱3～5 min，樣品經7.5% SDS-PAGE電泳分離，然后轉至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉3 h，TBST洗膜3次， 一抗4℃孵育過夜，TBST 洗膜3次， 加入1∶1 000二抗，室溫孵育30～60 min，ECL發光顯影，薄層掃描儀測定印跡區帶的光密度值。所有的實驗組與對照組重復3次。電泳后進行灰度分析并繪制灰度值柱形圖。 1.3 統計學處理 實驗所得數據用x±s表示，利用Sigma Stat 2.03統計軟件進行單因素方差分析，多樣本均數之間的比較采用q檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。 2 結 果 2.1 細胞的形態學表現 傳代的細胞呈梭形或柱形，核染色質較疏松，位于細胞的中央，核仁明顯，符合成骨細胞的形態學特征，細胞與UHMWPE顆粒可以在盛滿培養基的培養瓶中共存至少1周(圖1）。 2.2 流式細胞技術檢測細胞早期凋亡結果 空白對照組細胞培養第3、5天細胞凋亡率為0.48％、0.50％，UHMWPE顆粒干預組細胞培養第3、5天細胞凋亡率為0.53％、0.55％，2組比較無統計學意義（P＞0.05），見圖2。用Annexin V-FITC和碘化吡啶染色后，正常的活細胞不被Annexin V-FITC和碘化吡啶染色(左下角)；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-FITC染色，碘化吡啶染色呈陰性(右下角)；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-FITC和碘化吡啶染色(右上角)。 2.3 各組RT-PCR結果 與空白對照組細胞相比，UHMWPE顆粒干預組細胞Cbfα1的DNA條帶亮度增加（圖3），灰度值增加（圖4），差異有統計學意義（P<0.05）。 2.4 成骨細胞Cbfα1蛋白的表達 聚丙烯酰胺凝膠電泳結果表明UHMWPE顆粒干預組目的蛋白條帶亮度較空白對照組增強（P<0.05）（圖5）。 3 討 論 本實驗培養的成骨細胞呈貼壁生長，形態均勻一致，胞質透明顆粒少，單個核，具有多數學者報道的形態學特征［8-9］。成骨細胞體外培養為體外研究成骨細胞和骨代謝之間的關系提供了一個體外模型。通過體外培養可以研究植入材料的生物學特性，如生物相容性、生物毒性等，可以研究骨代謝過程中一些激素和細胞因子調節的過程和作用機制［10］。超高分子量聚乙烯(UHMWPE）一般指相對分子質量大于100萬的聚乙烯，具有生物相容性、化學穩定性、抗沖擊性及耐磨性好和摩擦系數低等優異的性能，作為人工關節窩材料與金屬或陶瓷關節頭材料組合構成現代人工關節。但是大量研究報道顯示，UHMWPE長期應用存在磨損現象，主要有2種磨損方式，一種生成剝離片、粒狀碎片，一種生成光滑波紋和微纖。產生的大部分磨屑為0.5～15 μm的粒子和纖維狀微粒［11］。Goodman等［12］在對比金屬與骨水泥磨屑中發現，超高分子聚乙烯磨屑激活巨噬細胞與成纖維細胞作用最強。臨床組織學觀察表明［13］：假體周圍最常見、數量最多的是UHMWPE顆粒，與假體周圍生物學反應的關系較其他顆粒更密切，因此UHMWPE顆粒是引起骨溶解和松動的最主要顆粒，當界膜內超過1×1010/g時，幾乎肯定發生骨溶解和松動［14］，假體壽命明顯縮短［15］。但UHMWPE顆粒較其他顆粒更容易引起骨溶解的機制尚未揭示。

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