作者：陳濤 盧婷利 張琰 傅經(jīng)國

【摘要】 目的 評估多支鏈的陽離子高分子聚合物——聚乙烯亞胺(PEI)單獨及與三種不同類別的常規(guī)抗菌藥物(兩性霉素B、氟康唑和多黏菌素B)聯(lián)合使用對白念珠菌(MY7245和MY7238)的兩種臨床分離物的抗真菌活性。方法 通過體外實驗測定不同分子質(zhì)量聚乙烯亞胺單獨及與三種不同類別的常規(guī)抗菌藥物聯(lián)合使用對兩株白念珠菌的最小抑菌濃度和殺滅時間，確定PEI單獨及聯(lián)合使用的體外抗真菌活性。結(jié)果 分子量在2～745ku范圍內(nèi)的PEI均對這兩種白念珠菌產(chǎn)生很好的抗真菌活性，且分子量小的PEI比分子量大的PEI的抗菌作用更顯著。與單獨作用的PEI相比，分子量較大的PEI與常規(guī)藥物聯(lián)合使用時可產(chǎn)生較強的協(xié)同作用。在體外致死研究實驗中可以看到，PEI-兩性霉素B和PEI-氟康唑結(jié)合物可以提高抑菌作用，但PEI-多黏菌素B結(jié)合物卻拮抗抑菌作用。結(jié)論 PEI單獨與聯(lián)合使用均對白念珠菌產(chǎn)生很好的抗菌效果。

【關(guān)鍵詞】 聚乙烯亞胺； 抗菌藥物； 白念珠菌； 體外抗真菌活性

ABSTRACT Objective To evaluate the antifungal activity of branched synthetic polymer， polyethylenimine(PEI)， alone and in combination with different antimicrobial agents against two clinical isolates of Candida albicans (MY7458 and MY7238).MethodsThe minimal inhibitory concentration (MIC) and time-killing rate of different sizes of polyethylanimine， alone and in combination with the drugs against two isolates of Candida albican were investigated.ResultsIt showed that PEIs at the molecule weight range of 2 to 745 ku were all efficiently fungicidal against two C.albicans isolates. Moreover， the smaller sized of PEIs were relatively more potent than its larger molecule counterpart. In contrast to fungicidal activity of PEI alone， larger sized PEI resulted in a higher synergistic effect when combining with the conventional antimicrobial agents. In vitro time-killing studies， the combination of PEI-amphotericin B and PEI-fluconazole enhanced antifungal activity， but there was an antagonist for the combination of PEI-polymyxin B.ConclusionsPEI alone and in combination with amphotericin B and fluconazole displayed the high antifungal activity against Candida albicans.

KEY WORDS Polyethylanimine;Antimicrobial agents;Candida albicans;In vitro anti-fungal activity

近年來，全身性真菌感染類型與頻率急劇上升［1，2］，白念珠菌是最普通的真菌病原體，是形成人體中大多數(shù)局部真菌感染的主要原因［3～5］。兩性霉素B與唑類化合物(如氟康唑、酮康唑)是目前應(yīng)用最廣泛的抗菌藥物［6］，兩性霉素B有著廣譜和有效的殺真菌活性，但與唑類化合物相比卻有著較大的毒性和較小的身體耐受性［7］。唑類抗真菌劑雖然具有較小的毒性［8］，但長期廣泛地使用已經(jīng)增加了念珠菌屬對氟康唑的耐受性并且出現(xiàn)了一些交叉耐藥性的跡象，因此迫切需要增加抗真菌藥物的治療指數(shù)，其中聯(lián)合使用一些抗真菌劑使其協(xié)同地發(fā)揮作用［9～11］，是被臨床證實的有效方法。

研究發(fā)現(xiàn)，帶正電荷的陽離子多肽對細菌和真菌有很強的殺滅作用，聚乙烯亞胺(PEI)是一種陽離子高分子聚合物，可作為一種體內(nèi)和體外基因傳染和遞送的載體［12］。我們研究了PEI單獨使用對白念珠菌的體外抗真菌活性［13］，而抗菌藥物與PEI的聯(lián)合使用未見報道。本文報道PEI與兩性霉素B、氟康唑和多黏菌素B聯(lián)合使用來抑制白念珠菌臨床分離物的體外敏感性測定。

1 材料和方法

1.1 材料

微生物菌株MY7245和MY7238分別來自全身真菌感染的患者黏膜并經(jīng)過微生物菌屬鑒定為白念珠菌，菌株保存于4℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。三種不同分子量(745、25、2ku)的PEI、兩性霉素B和多黏菌素B硫酸鹽均購自Sigma公司，氟康唑購自Pfizer公司。三種不同分子量的PEI均為無色或淡黃色液體，樹脂含量＞98%，5% PEI水溶液pH10～12，使用前將其pH調(diào)至7.0～7.2。所有樣品用重蒸餾水溶解配制為濃度10mg/L的溶液。

1.2方法

(1)抗真菌測定 體外抗真菌測定依據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI/NCCLS，2004年)制定的大量稀釋標(biāo)準(zhǔn)進行。測試培養(yǎng)基采用RPMI 1640(Gibco/BRL)，用0.165mol/L的三嗎啉丙磺酸(MOSP)緩沖液(pH7.0)配制。PEI與兩性霉素B配制為RPMI 1640培養(yǎng)基的100mg/L溶液，并逐步稀釋使最終濃度范圍為100～0.98mg/L。氟康唑和多黏菌素B配制為RPMI 1640培養(yǎng)基的80mg/L溶液，并稀釋使?jié)舛确秶鸀?0～0.156mg/L。用血細胞計數(shù)操作準(zhǔn)備濃度為1×106細胞/ml的接種物懸液，并稀釋以獲得1×104細胞/ml的接種量。抗真菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)定義為經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)(18～24h)后觀察不到細菌生長的最小藥物濃度；最小殺真菌濃度(MFC)定義為最終形成菌落數(shù)少于2～5個菌落形成單位時藥物的最小濃度，表現(xiàn)為初始接種物的殺滅率大于98%。

(2)殺滅時間測定 生長于沙氏葡萄糖瓊脂上的濃度為1×106細胞/ml的白念珠菌MY7458分離物按上述方法接種于RPMI 1640培養(yǎng)基中，并稀釋獲得約1×104細胞/ml的接種量。將1ml接種物懸液分裝試管中，于30℃分別培養(yǎng)0、3、6、24h，并逐漸稀釋到所需的濃度，接種在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于37℃培養(yǎng)24h進行活菌計數(shù)測定。

2 結(jié)果

2.1 PEI的抗真菌活性

Tab.1是三種不同分子量的PEI和常規(guī)三種不同抗菌藥物兩性霉素B、氟康唑和多黏菌素B對白念珠菌MY7458和MY7238兩種分離物的MIC與MFC值，說明PEI可抑制兩種白念珠菌分離物的增長，同時三種不同分子量的PEI，其抗真菌活性有一定的差異。就MIC值而言，745ku與25ku PEI對MY7458的MIC值為3.12mg/L，對MY7238則是1.56mg/L，而2kuPEI對兩種分離物的MIC值均為1.56mg/L。兩性霉素B對MY7458、MY7238的MIC分別是0.39和0.79mg/L，表明它的抗菌活性高于所有測試的PEI。氟康唑?qū)@兩種分離物的MIC值均為1.56mg/L，而抑制同樣數(shù)量的真菌則需要更高劑量的多黏菌素B(100mg/L)。為證實PEI及其它抗真菌劑的殺菌活性，亦評估了MFC。為殺滅MY7458需要濃度超過50mg/L的抗真菌藥物，而殺滅MY7238僅需要濃度為6.25mg/L的25ku PEI與745ku PEI，但需要濃度超過50mg/L的其他抗真菌藥物。

Tab.2是0.5倍MIC的次抑菌濃度的PEI與三種抗菌劑聯(lián)合使用時的MIC值，與抗菌劑單獨使用時相比，聯(lián)合使用的MIC均有所下降。兩性霉素B的MIC值由不加PEI的0.39mg/L降至0.097mg/L，而氟康唑的MIC值則由1.56mg/L降低至0.79mg/L，但對PMB而言加入PEI不對抗菌活性產(chǎn)生任何效果。同時表中的數(shù)據(jù)還表明，PEI的分子量大小不影響抗真菌劑的MIC值。

2.2 殺滅時間測定

Fig.1是濃度為0.5、1、2倍MIC的25ku PEI殺死MY7458的動力學(xué)，縱坐標(biāo)為真菌生長的對數(shù)值。圖中曲線表明，與不含PEI的對照樣品相比，所有濃度下培養(yǎng)3h之后，真菌生長減少了大約0.5對數(shù)生長量，6h之后則減少約2～2.5對數(shù)生長量，且殺滅率隨PEI濃度的增加而提高，這一增加的效果在24h后則更為顯著。這些結(jié)果表明PEI的殺菌緩慢(暴露時間)并具有濃度依賴性。

2.3 PEI聯(lián)合其他抗菌藥物的效果

Fig.2是兩種分子量的PEI(A：25ku，B：2ku)與兩性霉素B、氟康唑及多黏菌素B聯(lián)合抗MY7458的結(jié)果，每種藥物的濃度為0.5倍MIC的次抑菌濃度。表明當(dāng)在這三種常規(guī)抗菌藥物中添加兩種不同分子量

1: PSB; 2: 0.5×MIC; 3: 1×MIC; 4: 2×MIC

Fig.1The antifungal activity of PEI (25 ku) against

C.albicans isolate MY7458 (n=4， x±s)

的PEI時，都會使白念珠菌生存力有所下降，表明PEI的加入都或多或少地提高了常規(guī)抗菌藥物的活性，從其作用程度比較，兩性霉素B的促進作用最顯著，氟康唑次之，多黏菌素B的幅度最小。從PEI的濃度比較，濃度較大的PEI更有利于常規(guī)藥物抗真菌活性的提高。滅時間測定結(jié)果，表明聯(lián)合抗菌藥物的效果較緩慢且好于單一藥物，經(jīng)過6h的治療可以清楚地觀測到真菌生長的抑制，24h后對真菌的抑制更加顯著，表明聚合藥物的抗菌效果依賴于長時間的暴露。

3 討論

聚乙烯亞胺(PEI)是一種廣泛用于各種生物工藝過程的合成陽離子聚合物，常作為體外和體內(nèi)的基因載體，研究發(fā)現(xiàn)它對白念珠菌具有抗真菌活性［13］。為探究PEI在治療真菌感染中可能的應(yīng)用，我們在常用抗菌藥物的抗真菌活性基礎(chǔ)上，研究了不同濃度PEI的抗菌效果。與氟康唑相比，在低濃度時PEI抑制白念珠菌分離物的生長，其活性強于多黏菌素B，但弱于兩性霉素B。同時MFC測定獲得的結(jié)果也表明，利用更高濃度抗真菌劑稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基，極少能觀察到完全抑制真菌的生長，但分子量為25和745ku的PEI對MY7238分離物的抑制則是例外。PEI與其他抗真菌劑的MIC和MFC的區(qū)別，表明這些抗真菌劑和PEI在膜上的作用靶點并不類似，因此需要進一步的研究以確定PEI與膜之間的相互作用機制。研究結(jié)果表明PEI濃度較高時對兩性霉素B的活性有重要的促進作用，而在氟康唑和多黏菌素B的基礎(chǔ)上的作用較微弱，每種化合物的細胞作用靶點不同是PEI效果差異的一個原因。事實上，氟康唑作用于細胞質(zhì)中參與麥角固醇生物合成的羊毛固醇去甲基化酶，因此在氟康唑的存在下PEI應(yīng)當(dāng)在一定程度上干擾細胞膜，增加了氟康唑進入細胞質(zhì)的流入量，結(jié)果導(dǎo)致對白念珠菌的輕微抑制，其效果比單獨使用氟康唑好。兩性霉素B的主要作用靶點是麥角固醇，它是真菌細胞膜的一個組成成分。兩性霉素B與作用靶點結(jié)合導(dǎo)致細胞膜通透性的改變，使鉀、糖和代謝產(chǎn)物釋放出來，導(dǎo)致真菌死亡。盡管PEI(特別是濃度較高的PEI)與兩性霉素B之間的相互作用的機制還不清楚，但它們兩者對白念珠菌的協(xié)同作用卻是肯定的。這可能是由于PEI促進兩性霉素B的細胞攝取而導(dǎo)致真菌細胞膜完整選擇性的喪失，和(或)這種抗真菌劑作用靶點和兩性霉素B在細胞膜內(nèi)部的孔結(jié)構(gòu)的相互作用，增加了它的活性。由于麥角固醇位于質(zhì)膜上，PEI對細胞膜的改變能使麥角固醇容易地暴露給兩性霉素B，也就是說，由于PEI本身的陽離子特性，使它可以嵌入質(zhì)膜或與陰離子型膜組分(如蛋白和磷脂)相互作用而破壞細胞膜。

多黏菌素B是一種堿性多肽類抗菌藥物，其作用靶點位于細菌的外膜，這種多肽與其靶點的結(jié)合增加了外膜的透化作用，使化合物進入到細胞質(zhì)膜中，造成細胞質(zhì)組分外漏，導(dǎo)致細胞死亡。用多黏菌素B與三種不同分子量的PEI對真菌分離物聯(lián)合治療結(jié)果表明，對其抗真菌效果沒有明顯地促進作用，提示PEI與多黏菌素B之間不會發(fā)生有利于增加彼此進入的相互作用。

PEI具有一定的抗真菌活性，且這種抗真菌性與PEI濃度高低關(guān)系不大，同時與常規(guī)藥物聯(lián)合使用表明，在一定濃度下與兩性霉素B具有正效應(yīng)的抗真菌活性，而不對氟康唑與多黏菌素B具有積極的促進效果，這種差異可能與PEI的作用靶點、膜通透性以及PEI與常規(guī)藥物聯(lián)合使用的機制有關(guān)。PEI與兩性霉素B聯(lián)合使用還有待做進一步探索。

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