作者：陳濤 盧婷利 張琰 傅經國

【摘要】 目的 評估多支鏈的陽離子高分子聚合物——聚乙烯亞胺(PEI)單獨及與三種不同類別的常規抗菌藥物(兩性霉素B、氟康唑和多黏菌素B)聯合使用對白念珠菌(MY7245和MY7238)的兩種臨床分離物的抗真菌活性。方法 通過體外實驗測定不同分子質量聚乙烯亞胺單獨及與三種不同類別的常規抗菌藥物聯合使用對兩株白念珠菌的最小抑菌濃度和殺滅時間，確定PEI單獨及聯合使用的體外抗真菌活性。結果 分子量在2～745ku范圍內的PEI均對這兩種白念珠菌產生很好的抗真菌活性，且分子量小的PEI比分子量大的PEI的抗菌作用更顯著。與單獨作用的PEI相比，分子量較大的PEI與常規藥物聯合使用時可產生較強的協同作用。在體外致死研究實驗中可以看到，PEI-兩性霉素B和PEI-氟康唑結合物可以提高抑菌作用，但PEI-多黏菌素B結合物卻拮抗抑菌作用。結論 PEI單獨與聯合使用均對白念珠菌產生很好的抗菌效果。

【關鍵詞】 聚乙烯亞胺； 抗菌藥物； 白念珠菌； 體外抗真菌活性

ABSTRACT Objective To evaluate the antifungal activity of branched synthetic polymer， polyethylenimine(PEI)， alone and in combination with different antimicrobial agents against two clinical isolates of Candida albicans (MY7458 and MY7238).MethodsThe minimal inhibitory concentration (MIC) and time-killing rate of different sizes of polyethylanimine， alone and in combination with the drugs against two isolates of Candida albican were investigated.ResultsIt showed that PEIs at the molecule weight range of 2 to 745 ku were all efficiently fungicidal against two C.albicans isolates. Moreover， the smaller sized of PEIs were relatively more potent than its larger molecule counterpart. In contrast to fungicidal activity of PEI alone， larger sized PEI resulted in a higher synergistic effect when combining with the conventional antimicrobial agents. In vitro time-killing studies， the combination of PEI-amphotericin B and PEI-fluconazole enhanced antifungal activity， but there was an antagonist for the combination of PEI-polymyxin B.ConclusionsPEI alone and in combination with amphotericin B and fluconazole displayed the high antifungal activity against Candida albicans.

KEY WORDS Polyethylanimine;Antimicrobial agents;Candida albicans;In vitro anti-fungal activity

近年來，全身性真菌感染類型與頻率急劇上升［1，2］，白念珠菌是最普通的真菌病原體，是形成人體中大多數局部真菌感染的主要原因［3～5］。兩性霉素B與唑類化合物(如氟康唑、酮康唑)是目前應用最廣泛的抗菌藥物［6］，兩性霉素B有著廣譜和有效的殺真菌活性，但與唑類化合物相比卻有著較大的毒性和較小的身體耐受性［7］。唑類抗真菌劑雖然具有較小的毒性［8］，但長期廣泛地使用已經增加了念珠菌屬對氟康唑的耐受性并且出現了一些交叉耐藥性的跡象，因此迫切需要增加抗真菌藥物的治療指數，其中聯合使用一些抗真菌劑使其協同地發揮作用［9～11］，是被臨床證實的有效方法。

研究發現，帶正電荷的陽離子多肽對細菌和真菌有很強的殺滅作用，聚乙烯亞胺(PEI)是一種陽離子高分子聚合物，可作為一種體內和體外基因傳染和遞送的載體［12］。我們研究了PEI單獨使用對白念珠菌的體外抗真菌活性［13］，而抗菌藥物與PEI的聯合使用未見報道。本文報道PEI與兩性霉素B、氟康唑和多黏菌素B聯合使用來抑制白念珠菌臨床分離物的體外敏感性測定。

1 材料和方法

1.1 材料

微生物菌株MY7245和MY7238分別來自全身真菌感染的患者黏膜并經過微生物菌屬鑒定為白念珠菌，菌株保存于4℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養基。三種不同分子量(745、25、2ku)的PEI、兩性霉素B和多黏菌素B硫酸鹽均購自Sigma公司，氟康唑購自Pfizer公司。三種不同分子量的PEI均為無色或淡黃色液體，樹脂含量＞98%，5% PEI水溶液pH10～12，使用前將其pH調至7.0～7.2。所有樣品用重蒸餾水溶解配制為濃度10mg/L的溶液。

1.2方法

(1)抗真菌測定 體外抗真菌測定依據美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI/NCCLS，2004年)制定的大量稀釋標準進行。測試培養基采用RPMI 1640(Gibco/BRL)，用0.165mol/L的三嗎啉丙磺酸(MOSP)緩沖液(pH7.0)配制。PEI與兩性霉素B配制為RPMI 1640培養基的100mg/L溶液，并逐步稀釋使最終濃度范圍為100～0.98mg/L。氟康唑和多黏菌素B配制為RPMI 1640培養基的80mg/L溶液，并稀釋使濃度范圍為80～0.156mg/L。用血細胞計數操作準備濃度為1×106細胞/ml的接種物懸液，并稀釋以獲得1×104細胞/ml的接種量。抗真菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)定義為經37℃過夜培養(18～24h)后觀察不到細菌生長的最小藥物濃度；最小殺真菌濃度(MFC)定義為最終形成菌落數少于2～5個菌落形成單位時藥物的最小濃度，表現為初始接種物的殺滅率大于98%。

(2)殺滅時間測定 生長于沙氏葡萄糖瓊脂上的濃度為1×106細胞/ml的白念珠菌MY7458分離物按上述方法接種于RPMI 1640培養基中，并稀釋獲得約1×104細胞/ml的接種量。將1ml接種物懸液分裝試管中，于30℃分別培養0、3、6、24h，并逐漸稀釋到所需的濃度，接種在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上于37℃培養24h進行活菌計數測定。

2 結果

2.1 PEI的抗真菌活性

Tab.1是三種不同分子量的PEI和常規三種不同抗菌藥物兩性霉素B、氟康唑和多黏菌素B對白念珠菌MY7458和MY7238兩種分離物的MIC與MFC值，說明PEI可抑制兩種白念珠菌分離物的增長，同時三種不同分子量的PEI，其抗真菌活性有一定的差異。就MIC值而言，745ku與25ku PEI對MY7458的MIC值為3.12mg/L，對MY7238則是1.56mg/L，而2kuPEI對兩種分離物的MIC值均為1.56mg/L。兩性霉素B對MY7458、MY7238的MIC分別是0.39和0.79mg/L，表明它的抗菌活性高于所有測試的PEI。氟康唑對這兩種分離物的MIC值均為1.56mg/L，而抑制同樣數量的真菌則需要更高劑量的多黏菌素B(100mg/L)。為證實PEI及其它抗真菌劑的殺菌活性，亦評估了MFC。為殺滅MY7458需要濃度超過50mg/L的抗真菌藥物，而殺滅MY7238僅需要濃度為6.25mg/L的25ku PEI與745ku PEI，但需要濃度超過50mg/L的其他抗真菌藥物。

Tab.2是0.5倍MIC的次抑菌濃度的PEI與三種抗菌劑聯合使用時的MIC值，與抗菌劑單獨使用時相比，聯合使用的MIC均有所下降。兩性霉素B的MIC值由不加PEI的0.39mg/L降至0.097mg/L，而氟康唑的MIC值則由1.56mg/L降低至0.79mg/L，但對PMB而言加入PEI不對抗菌活性產生任何效果。同時表中的數據還表明，PEI的分子量大小不影響抗真菌劑的MIC值。

2.2 殺滅時間測定

Fig.1是濃度為0.5、1、2倍MIC的25ku PEI殺死MY7458的動力學，縱坐標為真菌生長的對數值。圖中曲線表明，與不含PEI的對照樣品相比，所有濃度下培養3h之后，真菌生長減少了大約0.5對數生長量，6h之后則減少約2～2.5對數生長量，且殺滅率隨PEI濃度的增加而提高，這一增加的效果在24h后則更為顯著。這些結果表明PEI的殺菌緩慢(暴露時間)并具有濃度依賴性。

2.3 PEI聯合其他抗菌藥物的效果

Fig.2是兩種分子量的PEI(A：25ku，B：2ku)與兩性霉素B、氟康唑及多黏菌素B聯合抗MY7458的結果，每種藥物的濃度為0.5倍MIC的次抑菌濃度。表明當在這三種常規抗菌藥物中添加兩種不同分子量

1: PSB; 2: 0.5×MIC; 3: 1×MIC; 4: 2×MIC

Fig.1The antifungal activity of PEI (25 ku) against

C.albicans isolate MY7458 (n=4， x±s)

的PEI時，都會使白念珠菌生存力有所下降，表明PEI的加入都或多或少地提高了常規抗菌藥物的活性，從其作用程度比較，兩性霉素B的促進作用最顯著，氟康唑次之，多黏菌素B的幅度最小。從PEI的濃度比較，濃度較大的PEI更有利于常規藥物抗真菌活性的提高。滅時間測定結果，表明聯合抗菌藥物的效果較緩慢且好于單一藥物，經過6h的治療可以清楚地觀測到真菌生長的抑制，24h后對真菌的抑制更加顯著，表明聚合藥物的抗菌效果依賴于長時間的暴露。

3 討論

聚乙烯亞胺(PEI)是一種廣泛用于各種生物工藝過程的合成陽離子聚合物，常作為體外和體內的基因載體，研究發現它對白念珠菌具有抗真菌活性［13］。為探究PEI在治療真菌感染中可能的應用，我們在常用抗菌藥物的抗真菌活性基礎上，研究了不同濃度PEI的抗菌效果。與氟康唑相比，在低濃度時PEI抑制白念珠菌分離物的生長，其活性強于多黏菌素B，但弱于兩性霉素B。同時MFC測定獲得的結果也表明，利用更高濃度抗真菌劑稀釋的標準液體培養基，極少能觀察到完全抑制真菌的生長，但分子量為25和745ku的PEI對MY7238分離物的抑制則是例外。PEI與其他抗真菌劑的MIC和MFC的區別，表明這些抗真菌劑和PEI在膜上的作用靶點并不類似，因此需要進一步的研究以確定PEI與膜之間的相互作用機制。研究結果表明PEI濃度較高時對兩性霉素B的活性有重要的促進作用，而在氟康唑和多黏菌素B的基礎上的作用較微弱，每種化合物的細胞作用靶點不同是PEI效果差異的一個原因。事實上，氟康唑作用于細胞質中參與麥角固醇生物合成的羊毛固醇去甲基化酶，因此在氟康唑的存在下PEI應當在一定程度上干擾細胞膜，增加了氟康唑進入細胞質的流入量，結果導致對白念珠菌的輕微抑制，其效果比單獨使用氟康唑好。兩性霉素B的主要作用靶點是麥角固醇，它是真菌細胞膜的一個組成成分。兩性霉素B與作用靶點結合導致細胞膜通透性的改變，使鉀、糖和代謝產物釋放出來，導致真菌死亡。盡管PEI(特別是濃度較高的PEI)與兩性霉素B之間的相互作用的機制還不清楚，但它們兩者對白念珠菌的協同作用卻是肯定的。這可能是由于PEI促進兩性霉素B的細胞攝取而導致真菌細胞膜完整選擇性的喪失，和(或)這種抗真菌劑作用靶點和兩性霉素B在細胞膜內部的孔結構的相互作用，增加了它的活性。由于麥角固醇位于質膜上，PEI對細胞膜的改變能使麥角固醇容易地暴露給兩性霉素B，也就是說，由于PEI本身的陽離子特性，使它可以嵌入質膜或與陰離子型膜組分(如蛋白和磷脂)相互作用而破壞細胞膜。

多黏菌素B是一種堿性多肽類抗菌藥物，其作用靶點位于細菌的外膜，這種多肽與其靶點的結合增加了外膜的透化作用，使化合物進入到細胞質膜中，造成細胞質組分外漏，導致細胞死亡。用多黏菌素B與三種不同分子量的PEI對真菌分離物聯合治療結果表明，對其抗真菌效果沒有明顯地促進作用，提示PEI與多黏菌素B之間不會發生有利于增加彼此進入的相互作用。

PEI具有一定的抗真菌活性，且這種抗真菌性與PEI濃度高低關系不大，同時與常規藥物聯合使用表明，在一定濃度下與兩性霉素B具有正效應的抗真菌活性，而不對氟康唑與多黏菌素B具有積極的促進效果，這種差異可能與PEI的作用靶點、膜通透性以及PEI與常規藥物聯合使用的機制有關。PEI與兩性霉素B聯合使用還有待做進一步探索。

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