作者：白利明，陳鴻輝，鄒海燕，葉春婷，沈雁，戴麗冰，梁佩紅

【摘要】 目的］探討聚乙烯醇體外編織構建組織工程前交叉韌帶支架材料的可行性。［方法］用聚乙烯醇紡絲纖維編織構建韌帶支架材料，在電子拉力機上測試該支架材料的力學性質；用組織塊和膠原酶消化培養法在體外分離培養人前交叉韌帶細胞并對細胞的生長形態和分泌膠原蛋白的特征進行檢測，細胞經體外擴增后種植于編織構建的聚乙烯醇韌帶支架材料上觀察。［結果］韌帶支架材料的柔韌性強，拉力測試的負荷—拉伸曲線與韌帶的拉伸曲線相似，其最大負荷、極限應力和彈性模量分別為52.61 N、14.96 MPa和202.08 MPa；體外分離培養的人前交叉韌帶細胞呈典型的成纖維細胞特征，能在體外分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原等細胞外基質；支架材料無細胞毒性，人前交叉韌帶細胞可在支架材料上黏附、生長并分泌細胞外基質。［結論］支架材料具有一定的力學性能和優良的生物相容性，有望成為一種組織工程前交叉韌帶支架材料。

【關鍵詞】 聚乙烯醇； 支架； 編織材料； 前交叉韌帶； 組織工程

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)斷裂是最常見的膝關節損傷之一。ACL斷裂無法自愈，用自體或異體移植物重建ACL是目前常用的治療方法［1］。自體移植物來源有限且多有供區部位并發癥；異體移植物也受來源限制，且有傳播疾病和產生免疫排異的風險；人工韌帶材料重建ACL的遠期療效還有爭議。組織工程技術的發展和應用為ACL重建提供了新的思路和方法。本文擬用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)編織構建韌帶支架材料，經檢測其性能，為臨床上重建ACL提供新材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Ⅰ型膠原酶(Gibco，USA)，高糖型DMEM培養基(Gibco，USA)，Ⅰ、Ⅲ型膠原單克隆兔抗鼠抗體、羊抗鼠IgG、SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)，PVA紡絲纖維(委托上海東華大學材料科學與工程學院制作)，60Co輻照消毒(廣州輻照技術研究中心協助)，電子拉力測試機(Hounsfield H25KSS，UK)，激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM510 META，Siemens，Germany)，掃描電子顯微鏡(PHILIPS ESEM30)。

1.2 方法

1.2.1 支架材料的制備和力學性能檢測

1.2.1.1 將1條PVA紡絲纖維經過鉤花制作為1條絲束，4條絲束為1股，用3股絲束編織構建組織工程ACL支架材料，60Co輻照消毒滅菌(8kGy)，種植細胞前使用DMEM培養基反復浸泡后過夜。

1.2.1.2 取6條編織好的支架材料充分浸泡濕潤后，在電子拉力機上，以速度100 mm／min、初始長度為1 cm進行拉力測試，記錄最大負荷、極限應力、最大應變及線性剛度等力學指標并繪制負荷—拉伸曲線，使用SPSS 11.5軟件包進行分析。

1.2.2 ACL細胞的分離培養及鑒定

1.2.2.1 取骨性關節炎患者未受損的ACL組織，參照組織塊和膠原酶消化培養法［2］在體外分離培養并擴增ACL細胞。

1.2.2.2 將培養3～5代ACL細胞進行吖啶橙(acridine orange，OA)染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察ACL細胞的形態特征。

1.2.2.3 在ACL細胞中加Ⅰ型和Ⅲ型膠原單克隆抗體(濃度為1∶200)，陰性對照僅加PBS。按照SABC免疫組化試劑盒的步驟檢測ACL細胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原的能力。

1.2.3 支架材料上種植ACL細胞

1.2.3.1 取3～5代ACL細胞懸液，以1×105／ml的濃度種植于支架材料上，2 h后復種1次，然后在37℃、5％CO2培養箱內孵育4～6 h，待細胞貼附于支架材料后，加入含10％胎牛血清的DMEM繼續培養，隔天換培養液1次，7 d后收集細胞—支架材料復合物。

1.2.3.2 細胞—支架材料復合物經2.5％戊二醛固定、常規脫水、CO2臨界點干燥、噴金，掃描電鏡觀察細胞在支架材料上的生長情況。

2 結果

2.1 編織構建的ACL支架材料無色透明，質地韌，充分浸泡后體積略有膨脹，柔韌性更強。拉力測試的負荷—拉伸曲線與韌帶的拉伸曲線相似，最大負荷為52.61±6.22 N，極限應力為14.96±2.28 MPa，彈性模量為202.08 MPa(表1)。

表1 聚乙烯醇編織支架材料拉力測試結果（略）

2．2 在體外分離培養的人ACL細胞形態呈梭形或多角形，核呈圓形或卵圓形，位于細胞中央，胞質向外伸出數個長短不一的突起，呈典型的成纖維細胞特征(圖1、2)。Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化測定可見ACL細胞的胞漿內富含橙黃色顆粒，主要分布在細胞核周圍，胞漿外無橙黃色顆粒出現，表明ACL細胞的胞漿內富含細胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型膠原，通過圖像分析可知細胞所分泌的I型膠原明顯較Ⅲ型膠原多(圖3、4)。

2.3 電鏡掃描可見支架材料孔徑大小不一，相互貫通，呈三維編織網絡結構；支架材料表面和孔內均有細胞生長，ACL細胞在支架材料上貼附生長并分泌細胞外基質(圖5、6)。

3 討論 組織工程ACL的關鍵要素之一就是要選擇合適的種子細胞。ACL細胞作為韌帶的結構和功能單位，在體外培養時可以較好地保持韌帶細胞表型，分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原能力強，有利于韌帶組織重建。Cooper JA等［3］將兔ACL、內側副韌帶、髕韌帶、跟腱4種成纖維細胞體外分離培養后，分別種植于編織的聚乳酸(polylactic acid，PLA)ACL支架材料上，結果發現ACL細胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白(fibronectin，FN)表達水平均高于其他3種成纖維細胞，認為ACL細胞作為組織工程ACL的種子細胞，可能優于其他3種成纖維細胞。本實驗在體外分離培養的ACL細胞形態呈梭形或多角形，細胞核呈圓形或卵圓形，位于細胞中央，胞質向外伸出數個長短不一的突起，呈典型的成纖維細胞特征。Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化測定表明，在體外培養的ACL細胞具有分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原的能力，且細胞分泌I型膠原比Ⅲ型膠原多。有研究表明［4］，人前交叉韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原的比例約為8∶1，ACL細胞分泌的Ⅰ型膠原明顯多于Ⅲ型膠原。但ACL細胞在體外培養時細胞增殖相對緩慢，如能解決其快速增殖和老化的問題，不失為理想的種子細胞。 PVA是一種水溶性高分子化合物，由醋酸乙烯酯溶液聚合后，再經堿催化醇解而得。PVA具有良好的水溶性和組織相容性，力學性能強，柔韌性好，無毒性，目前已廣泛應用于醫學領域。其分子鏈中的側鏈羥基可以結合黏附蛋白而對細胞具有較強的黏附作用，有利于細胞在PVA材料上黏附生長和增殖［5］。人體內雖缺乏PVA降解酶，但PVA材料改進制備后具有生物降解性［6，7］。潘政軍等［8］曾用PVA與膠原共聚物在體外構建了組織工程ACL支架材料，發現其具有優良的生物相容性和一定的力學性能。

圖1 組織塊培養的原代ACL細胞倒置相差顯微鏡(100×) （略） 圖2 第3代ACL細胞AO染色激光共聚焦顯微鏡(100×)（略）

圖3 第3代ACL細胞分泌Ⅰ型膠原普通光學顯微鏡(200×) （略）

圖4 第3代ACL細胞分泌Ⅲ型膠原普通光學顯微鏡(200×)（略）

圖5 ACL細胞在支架材料上分泌細胞外基質(SEM1000×) （略）

圖6 ACL細胞在支架材料上黏附生長(SEM125×)（略） 用編織技術構建組織工程ACL支架材料是目前發展趨勢之一。編織支架材料可以較好地模擬ACL纖維走向，可改善力學性能，兩端骨隧道部分和關節內部分的編織纖維可以形成不同的孔徑結構，有利于新生組織長入，為韌帶血管化和再生創造了條件［9］。JamesAC等［10］使用PLA纖維在體外編織構建的人ACL支架材料其最大負荷可以滿足人正常生理活動的需要，ACL細胞可以在支架材料上黏附、增殖和分泌細胞外基質。與前期實驗中PVA-膠原共聚物膜韌帶支架材料相比，本實驗編織韌帶支架材料的極限應力有所提高［8］，負荷—拉伸曲線與人ACL的相似，具有黏彈性的性質，材料的韌性增加，且有優良的細胞相容性；與人ACL相比，還不能滿足體內移植的力學要求，這可能與PVA紡絲纖維直徑較粗、纖度大，單位體積內的紡絲纖維數量較少，人工編織的角度、纖維走向、松緊程度等因素有關；與目前研究較多的聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等高分子材料相比，具有一定的優勢，PVA材料的親水性和柔韌性強，力學性能好，降解時間長，不會在局部產生酸性產物而引起炎癥反應。 在體外編織構建的ACL支架材料，具有一定的韌性和力學性能，ACL細胞可以在支架材料上黏附、增殖，具有良好的細胞相容性，但仍需通過改變PVA的分子量及制備工藝，使用機械編織，改進編織技術，進一步改善韌帶支架的力學性能，使之更接近ACL的力學要求，以期成為一種較理想的組織工程ACL支架材料。

【參考文獻】 ［1］ Savio LY W， Changfu W， Ozgur D， et al.前交叉韌帶重建與生物力學［J］.Journal of Orthopaedics and Research， 2006，1(9):31-39. ［2］ 陳鴻輝，唐毅，李斯明，等.膝關節韌帶成纖維細胞的培養及其生物學特性分析［J］.中華骨科雜志，2002，22(1):40-44. ［3］ Cooper JA， Bailey LO， Carter JN， et al.Evaluation of the anterior cruciate ligament，medial collateral ligament， Achilles tendon and patellar tendon as cell sources for tissueengineered ligament［J］. Biomaterial， 2006，27(13):2747-2754. ［4］ Zigang G， Fang Y， James CHG， et al.Biomaterials and scaffolds for ligament tissue engineering［J］. Bio Med Mater Res，2006，77:639-652. ［5］ Rachael H， Schmedlen， Kristyn S，et al.Photocrosslinkable polyvinyl alcohol hydrogels that can be modified with cell adhesion peptides for use in tissue engineering［J］. Biomaterials，2003，23:4325-4332. ［6］ Charles R， Nuttelman，Scott M，et al. Synthesis and characterization of photocrosslinkable， degradable poly(vinyl alcohol)based tissue engineering scaffolds［J］. Biomaterials，2002，23:3617-3626. ［7］ Congming X， Gaoyan Z. Synthesis and properties of degradable poly(vinyl alcohol) hydrogel［J］. Polymer Degradation and Stability， 2003， 81: 297-301. ［8］ 潘政軍，陳鴻輝，葉春婷，等.聚乙烯醇/膠原共聚物在組織工程前交叉韌帶支架材料中的實驗研究［J］.中國矯形外科雜志，2004，12(5)：368-370. ［9］ Ge Z， Goh JCH， Wang L， et al. Characterization of knitted polymeric scaffolds for potential use in ligament tissue engineering［J］.Biomater Sci Polymer Edn， 2005，16(9):1179-1192. ［10］James AC， Helen HL，Frank KK， et al.Fiberbased tissueengineered scaffold for ligament replacement: design considerations and in vitro evaluation［J］.Biomaterials，2005，26:1523-1532.