作者：白利明，陳鴻輝，鄒海燕，葉春婷，沈雁，戴麗冰，梁佩紅

【摘要】 目的］探討聚乙烯醇體外編織構(gòu)建組織工程前交叉韌帶支架材料的可行性。［方法］用聚乙烯醇紡絲纖維編織構(gòu)建韌帶支架材料，在電子拉力機(jī)上測試該支架材料的力學(xué)性質(zhì)；用組織塊和膠原酶消化培養(yǎng)法在體外分離培養(yǎng)人前交叉韌帶細(xì)胞并對細(xì)胞的生長形態(tài)和分泌膠原蛋白的特征進(jìn)行檢測，細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后種植于編織構(gòu)建的聚乙烯醇韌帶支架材料上觀察。［結(jié)果］韌帶支架材料的柔韌性強(qiáng)，拉力測試的負(fù)荷—拉伸曲線與韌帶的拉伸曲線相似，其最大負(fù)荷、極限應(yīng)力和彈性模量分別為52.61 N、14.96 MPa和202.08 MPa；體外分離培養(yǎng)的人前交叉韌帶細(xì)胞呈典型的成纖維細(xì)胞特征，能在體外分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)；支架材料無細(xì)胞毒性，人前交叉韌帶細(xì)胞可在支架材料上黏附、生長并分泌細(xì)胞外基質(zhì)。［結(jié)論］支架材料具有一定的力學(xué)性能和優(yōu)良的生物相容性，有望成為一種組織工程前交叉韌帶支架材料。

【關(guān)鍵詞】 聚乙烯醇； 支架； 編織材料； 前交叉韌帶； 組織工程

前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)斷裂是最常見的膝關(guān)節(jié)損傷之一。ACL斷裂無法自愈，用自體或異體移植物重建ACL是目前常用的治療方法［1］。自體移植物來源有限且多有供區(qū)部位并發(fā)癥；異體移植物也受來源限制，且有傳播疾病和產(chǎn)生免疫排異的風(fēng)險；人工韌帶材料重建ACL的遠(yuǎn)期療效還有爭議。組織工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為ACL重建提供了新的思路和方法。本文擬用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)編織構(gòu)建韌帶支架材料，經(jīng)檢測其性能，為臨床上重建ACL提供新材料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 Ⅰ型膠原酶(Gibco，USA)，高糖型DMEM培養(yǎng)基(Gibco，USA)，Ⅰ、Ⅲ型膠原單克隆兔抗鼠抗體、羊抗鼠IgG、SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)，PVA紡絲纖維(委托上海東華大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院制作)，60Co輻照消毒(廣州輻照技術(shù)研究中心協(xié)助)，電子拉力測試機(jī)(Hounsfield H25KSS，UK)，激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM510 META，Siemens，Germany)，掃描電子顯微鏡(PHILIPS ESEM30)。

1.2 方法

1.2.1 支架材料的制備和力學(xué)性能檢測

1.2.1.1 將1條PVA紡絲纖維經(jīng)過鉤花制作為1條絲束，4條絲束為1股，用3股絲束編織構(gòu)建組織工程ACL支架材料，60Co輻照消毒滅菌(8kGy)，種植細(xì)胞前使用DMEM培養(yǎng)基反復(fù)浸泡后過夜。

1.2.1.2 取6條編織好的支架材料充分浸泡濕潤后，在電子拉力機(jī)上，以速度100 mm／min、初始長度為1 cm進(jìn)行拉力測試，記錄最大負(fù)荷、極限應(yīng)力、最大應(yīng)變及線性剛度等力學(xué)指標(biāo)并繪制負(fù)荷—拉伸曲線，使用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析。

1.2.2 ACL細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

1.2.2.1 取骨性關(guān)節(jié)炎患者未受損的ACL組織，參照組織塊和膠原酶消化培養(yǎng)法［2］在體外分離培養(yǎng)并擴(kuò)增ACL細(xì)胞。

1.2.2.2 將培養(yǎng)3～5代ACL細(xì)胞進(jìn)行吖啶橙(acridine orange，OA)染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察ACL細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.2.2.3 在ACL細(xì)胞中加Ⅰ型和Ⅲ型膠原單克隆抗體(濃度為1∶200)，陰性對照僅加PBS。按照SABC免疫組化試劑盒的步驟檢測ACL細(xì)胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原的能力。

1.2.3 支架材料上種植ACL細(xì)胞

1.2.3.1 取3～5代ACL細(xì)胞懸液，以1×105／ml的濃度種植于支架材料上，2 h后復(fù)種1次，然后在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6 h，待細(xì)胞貼附于支架材料后，加入含10％胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液1次，7 d后收集細(xì)胞—支架材料復(fù)合物。

1.2.3.2 細(xì)胞—支架材料復(fù)合物經(jīng)2.5％戊二醛固定、常規(guī)脫水、CO2臨界點干燥、噴金，掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架材料上的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 編織構(gòu)建的ACL支架材料無色透明，質(zhì)地韌，充分浸泡后體積略有膨脹，柔韌性更強(qiáng)。拉力測試的負(fù)荷—拉伸曲線與韌帶的拉伸曲線相似，最大負(fù)荷為52.61±6.22 N，極限應(yīng)力為14.96±2.28 MPa，彈性模量為202.08 MPa(表1)。

表1 聚乙烯醇編織支架材料拉力測試結(jié)果（略）

2．2 在體外分離培養(yǎng)的人ACL細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多角形，核呈圓形或卵圓形，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)向外伸出數(shù)個長短不一的突起，呈典型的成纖維細(xì)胞特征(圖1、2)。Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化測定可見ACL細(xì)胞的胞漿內(nèi)富含橙黃色顆粒，主要分布在細(xì)胞核周圍，胞漿外無橙黃色顆粒出現(xiàn)，表明ACL細(xì)胞的胞漿內(nèi)富含細(xì)胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型膠原，通過圖像分析可知細(xì)胞所分泌的I型膠原明顯較Ⅲ型膠原多(圖3、4)。

2.3 電鏡掃描可見支架材料孔徑大小不一，相互貫通，呈三維編織網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；支架材料表面和孔內(nèi)均有細(xì)胞生長，ACL細(xì)胞在支架材料上貼附生長并分泌細(xì)胞外基質(zhì)(圖5、6)。

3 討論 組織工程ACL的關(guān)鍵要素之一就是要選擇合適的種子細(xì)胞。ACL細(xì)胞作為韌帶的結(jié)構(gòu)和功能單位，在體外培養(yǎng)時可以較好地保持韌帶細(xì)胞表型，分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原能力強(qiáng)，有利于韌帶組織重建。Cooper JA等［3］將兔ACL、內(nèi)側(cè)副韌帶、髕韌帶、跟腱4種成纖維細(xì)胞體外分離培養(yǎng)后，分別種植于編織的聚乳酸(polylactic acid，PLA)ACL支架材料上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACL細(xì)胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)水平均高于其他3種成纖維細(xì)胞，認(rèn)為ACL細(xì)胞作為組織工程ACL的種子細(xì)胞，可能優(yōu)于其他3種成纖維細(xì)胞。本實驗在體外分離培養(yǎng)的ACL細(xì)胞形態(tài)呈梭形或多角形，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，位于細(xì)胞中央，胞質(zhì)向外伸出數(shù)個長短不一的突起，呈典型的成纖維細(xì)胞特征。Ⅰ、Ⅲ型膠原免疫組化測定表明，在體外培養(yǎng)的ACL細(xì)胞具有分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原的能力，且細(xì)胞分泌I型膠原比Ⅲ型膠原多。有研究表明［4］，人前交叉韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原的比例約為8∶1，ACL細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原明顯多于Ⅲ型膠原。但ACL細(xì)胞在體外培養(yǎng)時細(xì)胞增殖相對緩慢，如能解決其快速增殖和老化的問題，不失為理想的種子細(xì)胞。 PVA是一種水溶性高分子化合物，由醋酸乙烯酯溶液聚合后，再經(jīng)堿催化醇解而得。PVA具有良好的水溶性和組織相容性，力學(xué)性能強(qiáng)，柔韌性好，無毒性，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。其分子鏈中的側(cè)鏈羥基可以結(jié)合黏附蛋白而對細(xì)胞具有較強(qiáng)的黏附作用，有利于細(xì)胞在PVA材料上黏附生長和增殖［5］。人體內(nèi)雖缺乏PVA降解酶，但PVA材料改進(jìn)制備后具有生物降解性［6，7］。潘政軍等［8］曾用PVA與膠原共聚物在體外構(gòu)建了組織工程ACL支架材料，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的生物相容性和一定的力學(xué)性能。

圖1 組織塊培養(yǎng)的原代ACL細(xì)胞倒置相差顯微鏡(100×) （略） 圖2 第3代ACL細(xì)胞AO染色激光共聚焦顯微鏡(100×)（略）

圖3 第3代ACL細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原普通光學(xué)顯微鏡(200×) （略）

圖4 第3代ACL細(xì)胞分泌Ⅲ型膠原普通光學(xué)顯微鏡(200×)（略）

圖5 ACL細(xì)胞在支架材料上分泌細(xì)胞外基質(zhì)(SEM1000×) （略）

圖6 ACL細(xì)胞在支架材料上黏附生長(SEM125×)（略） 用編織技術(shù)構(gòu)建組織工程ACL支架材料是目前發(fā)展趨勢之一。編織支架材料可以較好地模擬ACL纖維走向，可改善力學(xué)性能，兩端骨隧道部分和關(guān)節(jié)內(nèi)部分的編織纖維可以形成不同的孔徑結(jié)構(gòu)，有利于新生組織長入，為韌帶血管化和再生創(chuàng)造了條件［9］。JamesAC等［10］使用PLA纖維在體外編織構(gòu)建的人ACL支架材料其最大負(fù)荷可以滿足人正常生理活動的需要，ACL細(xì)胞可以在支架材料上黏附、增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)。與前期實驗中PVA-膠原共聚物膜韌帶支架材料相比，本實驗編織韌帶支架材料的極限應(yīng)力有所提高［8］，負(fù)荷—拉伸曲線與人ACL的相似，具有黏彈性的性質(zhì)，材料的韌性增加，且有優(yōu)良的細(xì)胞相容性；與人ACL相比，還不能滿足體內(nèi)移植的力學(xué)要求，這可能與PVA紡絲纖維直徑較粗、纖度大，單位體積內(nèi)的紡絲纖維數(shù)量較少，人工編織的角度、纖維走向、松緊程度等因素有關(guān)；與目前研究較多的聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等高分子材料相比，具有一定的優(yōu)勢，PVA材料的親水性和柔韌性強(qiáng)，力學(xué)性能好，降解時間長，不會在局部產(chǎn)生酸性產(chǎn)物而引起炎癥反應(yīng)。 在體外編織構(gòu)建的ACL支架材料，具有一定的韌性和力學(xué)性能，ACL細(xì)胞可以在支架材料上黏附、增殖，具有良好的細(xì)胞相容性，但仍需通過改變PVA的分子量及制備工藝，使用機(jī)械編織，改進(jìn)編織技術(shù)，進(jìn)一步改善韌帶支架的力學(xué)性能，使之更接近ACL的力學(xué)要求，以期成為一種較理想的組織工程ACL支架材料。

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