作者：劉華鋼 王博龍 秦三海 楊斌

【摘要】 目的探討氯化兩面針堿對人口腔鱗癌KB細(xì)胞周期和凋亡的影響及相互關(guān)系。方法應(yīng)用MTT比色法測定氯化兩面針堿對細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測氯化兩面針堿對細(xì)胞周期的影響；Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果氯化兩面針堿在體外呈濃度依賴性顯著抑制KB細(xì)胞的生長，48 h IC50為（2.36±0.22）μg/ml；與空白組相比，經(jīng)3μg/ml氯化兩面針堿作用， G2/M期細(xì)胞比例顯著增多；6 μg/ml時凋亡細(xì)胞比例最高，可見典型的核染色質(zhì)凝集、碎裂；9 μg/ml時，細(xì)胞凋亡率明顯下降，同時鏡下可見大量壞死細(xì)胞。結(jié)論 氯化兩面針堿抗KB細(xì)胞的方式與其劑量密切相關(guān)，低濃度時以G2/M期阻滯為主，中濃度時誘導(dǎo)凋亡，高濃度時則致其壞死。

【關(guān)鍵詞】 氯化兩面針堿 G2/M期阻滯 凋亡 壞死 KB細(xì)胞

Abstract：ObjectiveTo explore the influence of nitidine chloride on cell cycle and apoptosis of human carcinoma of mouth floor KB cells and their relationship.MethodsThe proliferation inhibition rate and IC50(48 h) of nitidine chloride to KB cells were examined by MTT assay. The influence of nitidine chloride on cell cycle was measured by flow cytometry. Hoechst33258 technology was adopted to detect cell apoptosis. Transmission electron microscope was used to observe cell ultrastructure.ResultsNitidine chloride markedly suppressed proliferation of KB cells in a dose-dependent manner in vitro， IC50 for 48h was （2.36±0.22）μg/ml. Compared with control group， after treated with 3μg/ml of nitidine chloride，the percentage of G2/M phase cells significantly increased.The highest apoptotic percentage and typical nuclear chromatine condensation and fragmentation were observed at the nitidine chloride concentration of 6 μg/ml.When KB cells were treated with nitidine chloride of 9 μg/ml，cell apoptosis rate significantly decreased ， many necrotic cells were seen under transmission electron microscope at the same time. ConclusionThe means of nitidine chloride inhibiting KB cells is closely associated with its dose，nitidine chloride induced G2/M phase arrest at low concentration， induced apoptosis at medium concentration and lead to necrosis at high concentration.

Key words：Nitidine chloride； G2/M phase arrest； Apoptosis； Necrosis； KB cells 細(xì)胞凋亡是當(dāng)前腫瘤研究中的熱點，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是許多抗腫瘤藥物發(fā)揮效應(yīng)的重要途徑。氯化兩面針堿是我國學(xué)者黃治勛等［1］從兩面針Zanthoxylum nitidum (Roxb)DC.植物的根中分離到的具有抗腫瘤活性的生物堿，與其抗腫瘤活性相關(guān)的研究多集中在藥效方面，為數(shù)甚少的抗腫瘤機(jī)制研究尚在爭論之中［2］，樊亦軍等［3］初步報道了其具有G2/M期阻滯效應(yīng)。氯化兩面針堿能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡尚未見報道，我們以人口腔鱗癌細(xì)胞KB為研究對象，系統(tǒng)研究了氯化兩面針堿對人口腔鱗癌KB細(xì)胞周期和凋亡的影響及相互關(guān)系。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑氯化兩面針堿購自中國藥品生物制品檢定所(批號11084820001，純度>98%)；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)購于AMRESCO公司；RPMI1640培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程公司；Hoechst33258購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司； RNase購自MBI；PI：Sigma。

1.2 儀器EpicsXL II型流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品，使用Muticycle AV分析軟件；酶聯(lián)免疫檢測儀Model450：BioRad ，USA；熒光顯微鏡：LeicaDMR+Q550，Germany；JEM1200EX型透射電鏡；CO2培養(yǎng)箱：Forma scientific Inc。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗癌細(xì)胞KB購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，用含10%新生牛血清以及青鏈霉素各100 U/ml的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率 將氯化兩面針堿用DMSO助溶，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基依次對半稀釋成五個梯度的母液，調(diào)整各濃度中DMSO含量至一致。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔0.19 ml（約0.3×104個/孔）接種于96孔板，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的氯化兩面針堿10 μl，使其終濃度分別為12，6，3，1.5，0.75 μg/ml，對照組加含等濃度DMSO的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每個梯度設(shè)4個復(fù)孔，其中DMSO終濃度為0.5%，孵育48 h每孔加入10 μl MTT（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后傾去培養(yǎng)液，加入DMSO 0.15 ml/孔，平板震蕩器振蕩5 min，充分溶解藍(lán)紫色顆粒，空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀以570 nm/630 nm雙波長測定去除本底光吸收值后的吸光度值，實驗重復(fù)3次，Bliss法計算IC50。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集3 μg/ml氯化兩面針堿處理0，12，24，48 h的細(xì)胞，PBS沖洗2次，用70%乙醇4℃固定過夜，PBS洗滌離心去上清，加入適量含100 mg/L RNaseA和50mg/L PI的染液，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×105個/ml左右，4℃避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)波長為488 nm，用MultiCycle AV軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析，以計算各期細(xì)胞百分率。

1.6 Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡 Hoechst33258為透膜性熒光染料，可與細(xì)胞核DNA結(jié)合，故正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞均可被Hoechst33258著色，但是正常細(xì)胞核的Hoechst著色很淺；而凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞體積縮小，染色質(zhì)固縮濃集、碎裂而呈濃染致密的亮藍(lán)色顆粒狀熒光，故用Hoechst33258可以準(zhǔn)確地標(biāo)記出凋亡細(xì)胞。收集0，3，6，9 μg/ml的氯化兩面針堿作用48h后的細(xì)胞，用PBS洗滌，低速離心去上清，加入0.5 ml 4%的多聚甲醛重懸細(xì)胞后4℃過夜，去固定液，PBS洗滌離心，用稀釋100倍的Hoechst33258染液重懸細(xì)胞。室溫孵育10 min，離心去染色液，用PBS洗滌離心，適量PBS重懸細(xì)胞后涂片，熒光顯微鏡下觀察，每組觀察3張片子，每片觀察3個視野，統(tǒng)計每個視野100個細(xì)胞的凋亡率。

1.7 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 氯化兩面針堿處理細(xì)胞同“1.6”項方法，消化離心去上清，加入10%牛血清蛋白100 μl重懸，再次離心，吸去多余牛血清蛋白，加適量4℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定，經(jīng)1%四氧化鋨預(yù)固定和后固定后，酒精及丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，作0.5 μm薄切片，醋酸雙氧鈾及構(gòu)椽酸鉛染色，JEM-1200EX型透射電鏡觀察、照相。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，數(shù)據(jù)用±s表示，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，統(tǒng)計學(xué)處理均使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 對細(xì)胞增殖的影響 如圖1所示，氯化兩面針堿對KB細(xì)胞生長呈劑量依賴性抑制，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率越來越低，48hIC50為（2.36±0.22）μg/ml，提示氯化兩面針堿在體外具有抗KB細(xì)胞增殖的作用。

圖1 氯化兩面針堿對細(xì)胞增殖的抑制作用(n=3)（略）

2.2 氯化兩面針堿對細(xì)胞周期的影響 從圖2可以看出，經(jīng)3 μg/ml氯化兩面針堿作用KB細(xì)胞12 h后，細(xì)胞周期分布就呈現(xiàn)明顯變化，即G0/G1期和S期細(xì)胞所占比例較未用藥組均明顯下降（P<0.01），G2/M期細(xì)胞比例（52.4±2.2%）顯著增加，與未用藥組（10.5±2.5%）相比有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。到48h時G2/M期細(xì)胞比例高達(dá)（72.7±2.2）%，然而與氯化兩面針堿作用24 h時的（70.2±2.1）%相比，G2/M期細(xì)胞比例無顯著性差異(P＞0.05)。這表明氯化兩面針堿對KB細(xì)胞有著明顯G2/M期阻滯效應(yīng)，其阻滯作用高峰在48 h之前。

圖2 流式儀周期圖（略）

2.3 氯化兩面針堿對細(xì)胞凋亡的影響如圖3所示，空白對照組細(xì)胞胞核染色很淺，輪廓不清。經(jīng)不同濃度氯化兩面針堿作用48 h后，各組中未凋亡細(xì)胞胞核呈現(xiàn)彌漫均勻的淺綠色熒光，形態(tài)均一， 隱約可見；而凋亡細(xì)胞皺縮變小，大小不一，部分破裂，胞核或胞質(zhì)內(nèi)濃染致密的亮藍(lán)色熒光顆粒清晰可見，有的呈現(xiàn)出典型的核碎裂式。統(tǒng)計顯示，結(jié)果隨藥物濃度的遞增，細(xì)胞凋亡率依次為(1.3±0.6)%，（2.5±0.5）%，（17±3）%，（9.5±2.3）%，其中與空白組相比有統(tǒng)計學(xué)差異的為6 μg/ml組和9 μg/ml組，而6μg/ml組和9μg/ml組相比P<0.05，可見氯化兩面針堿誘導(dǎo)KB細(xì)胞凋亡有一定的劑量范圍，并非濃度越高，凋亡率越高。

圖3 凋亡熒光顯微鏡照片（略）

2.4 氯化兩面針堿對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡下空白組細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞膜、核膜完整，胞核大，核仁多輪廓不規(guī)則，胞漿核糖體豐富，細(xì)胞表面有大量微絨毛（圖 4）；3 μg/ml和6 μg/ml組可見少量壞死細(xì)胞和許多不同程度的凋亡細(xì)胞，其細(xì)胞變小，胞質(zhì)濃縮，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，細(xì)胞核染色質(zhì)高度凝聚、邊集甚至碎裂解，細(xì)胞表面微絨毛消失（圖 5），且6 μg/ml組凋亡細(xì)胞明顯多于3 μg/ml；而在9 μg/ml組，凋亡細(xì)胞明顯減少，以壞死細(xì)胞為主，細(xì)胞核核膜不完整，核漿漏出，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器崩解，細(xì)胞表面微絨毛消失（圖 6），甚至可以看到部分細(xì)胞胞核連續(xù)電子致密帶斷裂、嗜鋨物脫落（圖 7），說明細(xì)胞核遭到了嚴(yán)重?fù)p傷。

圖4 空白組細(xì)胞（2 800×）（略）

圖5 凋亡細(xì)胞（2 800×）（略）

圖6 壞死細(xì)胞Ⅰ(2 800×)（略）

圖7 壞死細(xì)胞Ⅱ(2 800×)（略）

3 討論 腫瘤是一類細(xì)胞增殖周期紊亂性疾病，也是細(xì)胞凋亡失控性疾病，細(xì)胞周期的改變和細(xì)胞凋亡的關(guān)系越來越引起人們的重視，許多中藥有效成分［4～6］通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。而流式細(xì)胞術(shù)能夠準(zhǔn)確客觀地反映細(xì)胞的周期分布及凋亡情況，所以我們運用它來觀察氯化兩面針堿對人口腔鱗癌KB細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果顯示，3 μg/ml氯化兩面針堿對KB細(xì)胞有著明顯的G2/M期阻滯效應(yīng)，且出現(xiàn)時間早，24 h左右達(dá)高峰，48 h未見明顯增加，但代表細(xì)胞凋亡率的亞二倍體峰卻在各時間點上未檢到。因此，我們固定48 h的作用時間，逐漸增加氯化兩面針堿的濃度，改用熒光染料Hoechst33258來檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果3 μg/ml組凋亡率為（2.5±0.5）%，隨著濃度的增加，KB細(xì)胞凋亡率開始上升，6 μg/ml時達(dá)(17±3）%，而9 μg/ml時，細(xì)胞凋亡率又跌至（9.5±2.3）%，由此我們推測氯化兩面針堿誘導(dǎo)KB細(xì)胞凋亡可能存在一定的劑量范圍，濃度低時以G2/M期阻滯效應(yīng)為主，凋亡發(fā)生較少，這也許是我們流式未檢出凋亡的原因，但也并非濃度越高凋亡率越高，如9 μg/ml組反而降低。 細(xì)胞凋亡時超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型改變，如胞質(zhì)的固縮，染色質(zhì)濃縮成半月形或帽狀附于核膜，核的碎裂和凋亡小體形成等，這些特征在透射電鏡下得到最佳的體現(xiàn)，因而透射電鏡是細(xì)胞凋亡判定最直觀、最可靠的依據(jù)。我們電鏡結(jié)果顯示，0 μg/ml和3 μg/ml組凋亡細(xì)胞均較少；6 μg/ml組里核染色質(zhì)高度凝聚、邊集的典型凋亡細(xì)胞顯著增多，同時可見少量壞死細(xì)胞；而在9 μg/ml組，視野里可見大量壞死細(xì)胞，凋亡細(xì)胞明顯減少。以上結(jié)果說明氯化兩面針堿濃度過高時，抗KB細(xì)胞的方式以致其壞死為主，這也許可以解釋在Hoechst33258檢測法中9 μg/ml組細(xì)胞凋亡率的下跌。 綜合以上分析，我們認(rèn)為氯化兩面針堿顯著抑制KB細(xì)胞的增殖，作用方式與其濃度密切相關(guān)，低濃度時以G2/M期阻滯為主，中濃度時可誘導(dǎo)凋亡，高濃度時則以致其壞死為主。

【參考文獻(xiàn)】 ［1］ 黃治勛，李志和.兩面針抗腫瘤有效成分的研究［J］.化學(xué)學(xué)報，1980， 38(6)：535. ［2］ 楊洪勤，萬維勤，周 耘.抗腫瘤劑氯化兩面針堿在堿溶液中的反應(yīng)［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000 ，21(8)：756. ［3］ 樊亦軍，周 軍，李 茂.氯化光花椒堿對小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞生長周期的影響［J］.中國藥理學(xué)報，1981，2(1)：46. ［4］ 朱 青，張王剛，王立鋒，等.白藜蘆醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的作用及機(jī)制［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，26(21)：1935. ［5］ Alpana Tyagi， Chapla Agarwal， Gail Harrison， et al. Silibinin causes cell cycle arrest and apoptosis in human bladder transitional cell carcinoma cells by regulating CDKI-CDK-cyclin cascade， and caspase 3 and PARP cleavages［J］.Carcinogenesis， 2004，25（9）：1711. ［6］ Ya-Ling Hsu， Chien-Yu Cho， Po-Lin Kuo ，et al. Plumbagin (5-Hydroxy-2-methyl-1，4-naphthoquinone) Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest in A549 Cells through p53 Accumulation via c-Jun NH2-Terminal Kinase-Mediated Phosphorylation at Serine 15 in Vitro and in Vivo［J］.Pharmacol. Exp. Ther， 2006，318(8)：484.