作者：李輝， 任平， 黃熙， 唐文富， 魏宏強

【摘要】 目的：研究高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)同時測定健康人口服加味逍遙散(Modified XiaoYao Decoction， MXYD)后血清中阿魏酸和芍藥苷含量及其藥動學。方法：水浴法預處理血樣，HPLC法同時測定8名健康人在口服加味逍遙散濃縮湯劑后8個時間點各個血清樣本中芍藥苷與阿魏酸的血藥濃度。應用3P97藥動學分析軟件對血藥濃度時間數據進行擬合。選用香豆精為內標，芍藥苷和阿魏酸檢測波長分別為：0～10 min為230 nm和10～25 min為320 nm。結果：8名健康志愿者口服MXYD濃縮湯劑后，在血清中檢測到芍藥苷和阿魏酸。兩種化合物分離完全，未出現其他物質干擾峰，保留時間(retention time， Tr)分別為8.02 min和13.32 min，內標香豆素為19.14 min。芍藥苷和阿魏酸的平均回收率分別為100.9 %和95.3%，平均相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為3.4%和3.2%。用空白血清加標準品繪制標準曲線，芍藥苷線性范圍為40～1 280 ng/ml，信噪比為3時最低檢測線為5 ng/ml，最低檢測濃度為15 ng/ml（RSD=12.5%）；阿魏酸線性范圍為10～320 ng/ml，最低檢測線為0.65 ng/ml，最低檢測濃度5 ng/ml（RSD=9.7 %）。成分日間與日內精密度及準確度在92.1%～109.9%，且RSD<5%。結論：采用高效液相色譜法對人體服用加味逍遙散后血清中的芍藥苷和阿魏酸進行同步測定，適用于臨床試驗中血清芍藥苷和阿魏酸的定性定量研究。

【關鍵詞】 加味逍遙散; 芍藥苷; 阿魏酸; 高效液相色譜; 藥動學

Objective: To simultaneously determine the contents and explore the pharmacokinetics of ferulic acid and paeoniflorin by high performance liquid chromatography (HPLC) after oral administration of Modified Xiaoyao Decoction (MXYD)， a compound of traditional Chinese herbal medicine.

Methods: A total of 8 healthy men were enlisted in this study. The serum samples were preprocessed by immersion method. The HPLC system was used to determine the contents of ferulic acid and paeoniflorin in the blood samples of the 8 healthy volunteers， and the blood was collected through the ulnar vein at 5 min， 10 min， 15 min， 30 min， 45 min， 1 h， 2 h and 3 h after MXYD administration. The dates of serum concentrationtime were fitted by using the 3P97 analytical program of pharmacokinetics. The internal standard (IS) was coumarin. The detection wavelengths of paeoniflorin and ferulic acid were 230 nm from 0 min to 10 min and 320 nm from 10 min to 25 min respectively.

Results: After MXYD administration， paeoniflorin and ferulic acid were separated completely in the serum and no other interfering peaks were found in the spectrum of the chromatograms. The retention times of the paeoniflorin and ferulic acid were 8.02 min and 13.32 min respectively， and that of the coumarin was 19.14 min. The mean recovery rates of paeoniflorin and ferulic acid were 100.9% and 95.3% with relative standard deviation (RSD) of 3.2% and 3.4%， respectively. The calibration curve for paeoniflorin was linear over the concentration range 401 280 ng/ml. Its lowdetection limit based on a signaltonoise ratio of 3 was 5 ng/ml and lowconcentration limit was 15 ng/ml with an RSD of 12.5%. Ferulic acid was in the range 10320 ng/ml; its lowdetection limit was 0.65 ng/ml and lowconcentration limit was 5 ng/ml with an RSD of 9.7%. The method was found to be highly precise， with an RSD<5% and interday and intraday variability in the range of 92.1%109.9% for each of the concentrations tested.

Conclusion: This is a study on simultaneously determining paeoniflorin and ferulic acid in serum of healthy volunteers after oral administration of MXYD. The assay is suitable for identifying the serum levels of ferulic acid and paeoniflorin in clinical investigations.

Keywords: Jiawei Xiaoyao Powders; paeoniflorin; ferulic acid; high performance liquid chromatography; pharmacokinetics

自擬加味逍遙散（Modified Xiaoyao Decoction， MXYD）由《太平惠民和劑局方》中的逍遙散加減而成，適用于治療抑郁［1］和脾氣虛型、肝郁脾虛型功能性消化不良［2］。阿魏酸和芍藥苷分別來自當歸和白芍，是該方的兩個主要成分。楊玉興等［3］應用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）對人服用加味逍遙散后血清中的阿魏酸進行了定性和定量研究；Yang等［4］對狗服用精制后芍藥苷的藥動學進行了研究；羅煥敏等［5］對大鼠服用當歸芍藥散后體內芍藥苷與阿魏酸同時進行測定，并進行藥動學研究。人口服后這兩成分的同時檢測及藥動學研究未見報道。因此，我們利用HPLC對健康人口服加味逍遙散后血清中的芍藥苷與阿魏酸進行測定，以便指導加味逍遙散在臨床中的應用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 Waters HPLC，包括2996二極管陣列檢測器、2695自動進樣系統和EmpowerTM 數據處理軟件（美國Waters公司）；小神醫煎藥機（天津三延精密機械有限公司）；3P97藥動學分析軟件（中國藥理學會數學藥理專業委員會）。

1.2 藥品與試劑 自擬加味逍遙散由當歸25 g、白芍藥25 g、柴胡25 g、茯苓25 g、白術15 g、生姜10 g、大棗15 g、薄荷15 g、梔子15 g、甘草15 g、牡丹皮15 g、厚樸30 g、枳殼30 g和葛根40 g組成。藥材購自四川大學華西醫院門診中藥房，均經華西醫院中藥藥理實驗室鑒定為正品。加味逍遙散湯劑制備：按照處方比例精確稱取各組成藥物，總量2.7 kg，放入小神醫煎藥機中，添加8倍水，浸泡約30 min后煎煮，煮沸后繼續煎煮30 min，然后用4層紗布過濾；按上述方法重復煎煮1次。兩次煎出濾液合并，32 ℃減壓濃縮，使其終濃度為1 g/ml。冷卻后置于消毒容器中，密封保存于4 ℃冰箱內備用，用時搖勻，溫服。阿魏酸（批號為1107739910）、芍藥苷（批號為110736200423）和香豆素（批號為911216）標準品均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.3 健康志愿者入選標準 健康男性8名，來源于招募者。納入標準：體格檢查正常；年齡19～40歲；體質量正常（在標準體質量±10%之內）；獲取知情同意，志愿受試。排除標準：有藥物及食物過敏史者；1個月內服用過藥物者；有暈血、暈針史；精神病患者；嗜煙、嗜酒者；既往有心、肝、腎、胃腸及造血功能障礙等嚴重疾病者；依從性差者。剔除標準：實驗后發現有違背實驗方案或使用過影響藥物測定的藥物和食物，可能干擾實驗結果者。終止實驗標準：從醫學角度考慮受試者有必要中止實驗者，如實驗過程中發生暈針、暈血，服藥后有不適感或過敏反應等。

本研究已獲得倫理委員會批準，自愿受試、體檢合格者入選。入選者于實驗前簽署知情同意書。

1.4 實驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS3（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為甲醇︰0.5%乙酸水溶液（40︰60，v/v），選用香豆精為內標(internal standard， IS)；芍藥苷的檢測波長在0～10 min為230 nm；阿魏酸的檢測波長在10～25 min為320 nm。

1.4.2 標準品溶液配制 阿魏酸1 mg置于容量瓶內，加入50 ml甲醇搖勻；芍藥苷1 mg，甲醇定容至50 ml；取香豆素2 mg，甲醇定容至100 ml。3種溶液最終濃度均為20 mg/L。

1.4.3 給藥與采血 志愿者于實驗前3 d不得飲用啤酒、茶、咖啡及其他飲料；實驗前8 h不準進水和食物。實驗當天測定其空腹體質量及心率、脈搏、血壓；每位志愿者在服用濃縮中藥湯劑前抽取靜脈血，作為空白對照。取血后按5 g/kg口服一次中藥濃縮湯劑。服藥后計時，于服藥后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h和3 h于肘靜脈抽血5 ml；隨時記錄受試者出現的各種反應，遇特殊情況積極處理；口服中藥前與服藥后各時間點血標本于3 000 r/min離心10 min，獲得空白與含藥血清，分裝于1.5 ml EP管中，－20 ℃保存。

1.4.4 血清樣品的預處理 所有血清（包括空白血清、含藥血清及空白加入標準品的血清）均采用水浴法預處理。取1 ml血清放入10 ml試管中，在100 ℃沸水中10 min，攪拌60 s直至均勻，于8 500 r/min離心15 min，取100 μl上清進樣。

1.4.5 制作標準曲線及測定最低檢測限 取6份1 ml空白血清，分別放入10 ml試管中，加入不同體積的芍藥苷和阿魏酸標準品溶液，使芍藥苷和阿魏酸在血清中的濃度分別為40、80、160、320、640、1 280 ng/ml和10、20、40、80、160、320 ng/ml。每管分別加入香豆素標準品溶液25 μl，充分混勻后采用上述水浴法預處理，HPLC測定。分別以芍藥苷、阿魏酸和內標香豆素的峰面積比與其濃度作線性回歸，得到回歸方程；當信噪比（signaltonoise， S/N）為3時確定芍藥苷與阿魏酸的最低檢測限。

1.4.6 精密度與回收率的測定 取3份1 ml空白血清，分別放入10 ml試管中，加入不同體積的芍藥苷和阿魏酸標準品溶液，使兩者在血清中的濃度分別為40、160、640 ng/ml和10、40、160 ng/ml 3個梯度。每管分別加入香豆素標準品溶液25 μl，充分混勻后按上述血清預處理方法處理后進樣100 μl檢測。重復上述實驗過程，5次/d，使用相同的樣品與方法連續測定5 d。以加入血清中芍藥苷和阿魏酸的量為標準值，實際測得的峰面積比值代入回歸方程計算出計算值，計算值與標準值相比求得回收率和日內精密度，并計算出相對標準偏差（relative standard deviation， RSD）。計算公式分別為：回收率=(計算值/標準值)×100%；精密度=(計算值的平均值/加入標準濃度)×100%；RSD=(標準差/平均值)×100%。

1.4.7 樣本血藥濃度的測定 對8名志愿者服藥后各個時間點的含藥血清進行預處理，以本實驗色譜條件進樣，得到芍藥苷、阿魏酸峰面積與香豆素峰面積的比值，將比值代入回歸方程，分別得到芍藥苷和阿魏酸的血藥濃度，并繪制血清藥物濃度與時間曲線。

1.4.8 藥代動力學參數的測定 采用中國藥理學會數學藥理專業委員會編制的3P97藥動學分析軟件對測得血藥濃度數值進行擬合得到一系列藥動學參數：最大出峰時間（time of maximum concentration， Tmax），最大血藥濃度（maximum concentration， Cmax）、分布相半衰期（t1/2α）、表觀清除率（apparent clearance， CL/F）和血藥濃度時間曲線下面積（area under concentrationtime curve， AUC）等。

2 結 果

2.1 芍藥苷、阿魏酸與內標香豆素的分離情況 芍藥苷、阿魏酸峰與內標峰，血清內源性物質及加味逍遙散吸收入血的其他成分峰均能很好地實現基線分離，無雜峰干擾；芍藥苷、阿魏酸和香豆素標準品在相同條件下進行對照，保留時間分別為8.02、13.32和19.14 min；對其紫外吸收峰予以定性分析，樣品的最大紫外掃描波長與標準品一致。見圖1和圖2。

2.2 標準曲線及最低檢測限 空白血清加入芍藥苷標準品后，在40～1 280 ng/ml濃度范圍內的線性回歸方程為y=59.5x+5.48（x代表峰面積比值，y代表血藥濃度）(r2=0.999 1)。S/N為3時最低檢測限為5 ng/ml，最低檢測濃度為15 ng/ml（RSD=12.5%）。空白血清加入阿魏酸標準品后，在10～320 ng/ml濃度范圍內的回歸方程為y=161.3x－7.82（r2 =0.992 3），最低檢測限為0.65 ng/ml，最低檢測濃度為5 ng/ml（RSD=9.7%）。

2.3 回收率與精密度 健康人空白血清加入芍藥苷和阿魏酸標準品后的平均回收率分別為100.9%和95.3%，平均RSD分別為3.4%和3.2%。見表1。該方法檢測芍藥苷和阿魏酸日間、日內精密度在92.1%～109.9%，且RSD<5%，均符合分析檢測要求，顯示了很好的可重復性。見表2和表3。圖1 不同血清樣品中阿魏酸、芍藥苷和內標香豆素的高效液相色譜圖 表1 芍藥苷和阿魏酸的回收率表2 芍藥苷和阿魏酸日間精密度表3 芍藥苷和阿魏酸日內精密度

2.4 血藥濃度測定 將健康人服藥后各個時間點血清中測得的芍藥苷和阿魏酸峰面積與內標峰面積相比，所得比值分別代入兩者的回歸方程，計算出血清中芍藥苷和阿魏酸的濃度并繪制血清藥物濃度時間曲線。見圖3。

2.5 藥動學參數的測定 本實驗成功地在服藥后健康人的血清中檢測到了芍藥苷和阿魏酸，并建立了同時檢測芍藥苷與阿魏酸的高效液相色譜法，使用藥動學軟件得到藥動學參數（表4）。藥動學參數顯示人口服MXTD后芍藥苷和阿魏酸被吸收入體內，兩者的最大濃度時間大約在服藥后45 min左右，然后逐漸下降。表4 芍藥苷與阿魏酸在血清中的藥動學參數

3 討 論

湯藥進入體內后，血清成分多樣，欲確定方劑體內血清成分譜，必須建立湯藥進入體內多成分測定方法。本實驗完成了健康人口服大復方MXYD濃縮劑后芍藥苷與阿魏酸在血中的測定研究，利用HPLC法對芍藥苷與阿魏酸同時測定，為其他藥效成分的測定方法和藥動學研究打下了一定基礎，對臨床治療功能性消化不良的中藥復方的質量、用量等監測有一定意義。

MXYD治療功能性消化不良療效確切。由于是大復方，其中所含化學成分可達幾百種，但進入人體的成分才可能是藥效成分，所以研究服藥后進入人體的成分才能更好地了解加味逍遙散的藥理作用。對于MXYD的藥動學研究已有開展，但報道多數是單味中藥［3］或者動物實驗［6］。中藥藥動學研究最終要回歸于對人體的實驗。故本實驗以“復方效應成分動力學”假說和“生物方劑分析中醫藥學”思路為理論指導基礎，應用HPLC法分析了人口服加味逍遙散后吸收入體內成分芍藥苷與阿魏酸的藥動學。

本實驗建立的檢測方法顯示了較好的線性關系，具有較好的精密度和準確度。有報道使用內標法根據回歸方程計算得到兩者的血藥濃度，通過對大鼠血清中阿魏酸與芍藥苷的藥動學研究，結果顯示兩者最大血藥濃度出現時間在2 h和3 h，半衰期1～2 h［5］，明顯大于本實驗結果。這說明不同實驗對象對藥物的吸收與體內反應是不同的。本實驗方法適用于人口服加味逍遙散濃縮煎劑后芍藥苷與阿魏酸血藥濃度的測定，為進一步研究加味逍遙散中代表療效的靶成分以及臨床用藥量化依據打下了基礎。

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