作者：王冰水易南李玲馬虹王建波王虹

【關鍵詞】 激光

關鍵詞: 激光;大鼠;脊髓;降鈣素基因相關肽

摘 要:目的 研究10mW氦氖（He-Ne）激光照射對大鼠坐骨損傷神經后脊髓CGRP表達的影響. 方法 96只SD大鼠制成坐骨神經損傷模型，He-Ne激光照射損傷的坐骨神經，免疫組化方法觀察脊髓內CGRP的變化. 結果 神經損傷后1d脊髓內CGRP表達即增加;2wk及4wk時激光照射組CGRP的表達高于對照組，陽性表達主要存在于脊髓灰質內前角運動神經元和背根感覺纖維;8wk時CGRP仍保持較高水平的表達，二組無明顯差異. 結論 10mW He-Ne激光照射大鼠損傷的坐骨神經可引起脊髓內神經元CGRP表達的變化，有促進完成神經再生的作用.

Keywords:laser;rat;spinal cord;calcitonin gene-related peptide

Abstract:AIM To study the expression of calcitonin gene-related peptide（CGRP）in spinal cord after irradiation on in-jured sciatic nerve of rat by He-Ne laser with output power of10mW.METHODS Injured sciatic nerves，made in96SD rats，were irradiated by He-Ne laser.The changes of CGRP in spinal cord were immunohistochemically studied.RE┐SULTS Expression of CGRP increased in spinal cord on the first day after injury of sciatic nerve.More expression ofCGRP in second and fourth week was observed in laser irradi-ation group compared to control group.The positive sub-stance was mainly found in motor neuron in anterior horn and sensory nerve fiber in posterior horn.At eighth week，CGRP remained a high expression in both groups，and showed no significant difference.CONCLUSION Expression of CGRP in spinal cord can be changed by He-Ne laser irradiation with power output of10mW on injured sciatic nerve in rat.He-Ne laser irradiation can promote nerve regeneration.

0 引言

He-Ne激光有廣泛的生物學作用，動物實驗和臨床觀察均證實激光照射有促進外周神經生長的作用［1］ ，其作用機制尚待探討.降鈣素基因相關肽（cal-citonin gene-related peptide，CGRP）是由37個氨基酸殘基組成的神經多肽［2，3］ ，起著遞質或細胞外調節物樣作用，由降鈣素基因家族編碼，但化學結構、體內分布及生物活性不同于降鈣素，主要分布在神經系統中［4］ ，具有舒血管作用，在神經再生過程中起一定作用［5］ .我們觀察了He-Ne激光照射損傷大鼠坐骨神經后脊髓CGRP表達的變化.

1 材料和方法

1.1 動物模型及照射方法 SD成年雄性大鼠96只，體質量（250±20）g，10g L -1 戊巴比妥鈉（30mg kg

-1 ，ip）麻醉，常規消毒，取右側股后外側暴露坐骨神經，于神經分叉上0.7cm處眼科剪剪斷，并修剪神經斷端的覃狀頭，原位吻合以9個0的絲線縫合神經外膜4～6針，吻合后創口內放入慶大霉素2萬單位關閉創口，對等分激光照射組和對照組各48只處理.He-Ne激光器（西安產）波長632.8nm，激光照射組照射功率為10mW，每次使用前激光功率計檢測激光器的功率輸出.照射時光斑直徑0.6cm，功率密度為35.39mW cm-2 ，對準神經吻合處每次照射10min，照射能量密度為21.23J cm-2 ，對照組做相同處理，激光照射功率輸出為0mW，每日1次，連續10d.

1.2 免疫組織 分別從照射1d開始，于照射前、照射后1，3d，1，2，4，6和8wk，照射組和對照組各取6只大鼠，10g L-1 戊巴比妥鈉2mL，ip，待大鼠麻醉后，依次剪開胸腔、右心房、心室，而后剪開左心室，將輸液管通過左心室插入主動脈內，生理鹽水快速灌注150mL，40g L-1 多聚甲醛快速灌注200mL，緩慢滴注300mL，持續1.5～2h，而后取坐骨神經及相應脊髓，浸入200g L-1 蔗糖液（0.01mol L-1 PB）4℃過夜，恒冷箱切片，片厚30μm.用0.01mol L-1 PBS清洗10min×3→浸入含3g L-1 Triton×100的0.01mol L -1 PBS30min→0.01mol L

-1 PBS清洗10min×3→加羊抗CGRP（1 2000，Sigma）4℃孵育48h，取出入0.01mol L-1 PBS清洗10min×3→加入兔抗羊抗體（1 200，Sigma）室溫孵育2h→入0.01mol L-1 PBS清10min×3→浸入ABC復合物（1 500，Sigma）室溫孵育2h，浸洗硫酸鎳胺加強的DAB藍色反應法顯色、貼片、干燥、脫水、透明、中性樹膠封片.應用Leica Q570c真彩色圖像分析儀（德國），進行灰度定量分析，每張切片在損傷側后角的第3，4板層選5個高倍視野進行陽性物質密度值測定，取測定數值減去背景測定數值的絕對值，t檢驗統計分析.

圖1 － 圖2 略

2 結果

成年大鼠腰骶段脊髓中CGRP陽性反應的細胞數目較少，每一切面多為有1～2個CGRP陽性反應細胞，均為前角運動神經元，染色較淡，無明顯陽性纖維，陽性反應細胞多為大細胞，呈圓形或多角形，樹突較短，陽性物質主要集中在胞質，胞核為陰性.坐骨神經損傷后1d即發現損傷側CGRP陽性反應增強，1wk以內激光照射組和對照組無明顯差異，此時神經元突起明顯，少量神經元間有較長的陽性纖維，后角CGRP陽性反應纖維較多.2wk時激光照射組CGRP陽性反應較對照組更明顯，前角運動神經元陽性個數明顯多于對照組（Fig1A，1B），細胞陽性染色較重，集中在胞質，胞體突起較多，有的細胞有較長的CGRP陽性纖維向外伸展，未損傷側前角運動神經元陽性個數也少量增加.損傷側后角陽性纖維排列密集，走形較雜亂，纖維上有較多的CGRP陽性膨體，呈串珠狀（Fig2A，2B），脊髓后角第3，4脊髓板層內損傷側CGRP反應陽性的灰度值測定（Tab1），顯示第2，4周時激光照射組高于對照組（P<0.01），第6周時仍保持較高水平，第8周時激光照射組與對照組已無明顯差異，但均高于正常水平.

表1 脊髓后角CGRP陽性反應的灰度值略

3 討論

He-Ne激光是波長632.8nm的相干光，有廣泛的生物學效應，作用于生物組織可使生物膜分子構象發生改變，改變膜受體結構，使細胞活性發生變化，有明顯的生物學刺激作用［6］ . 神經修復是一個較為復雜的過程，外周神經元損傷后可產生一系列的化學和組織學變化，一般認為，在這種變化中，與神經遞質代謝有關的酶蛋白的合成下調，而與軸突存活和修復有關的結構蛋白的合成增加，如神經生長因子（NGF）［7］ 和生長相關蛋白（GAP-43）［8］ 的表達.外周軸突損傷后，可導致CGRP在運動神經元中含量增高，而He-Ne激光作為一種外界物理因子，通過其生物刺激作用使脊髓內CGRP表達增高.激光照射組2wk時前角運動神經核團CGRP陽性反應較對照組更強烈，陽性細胞數目明顯多于對照組，激光照射組的后角陽性神經纖維密集，數量多，染色重，較對照組陽性物質明顯增多.神經元產生的CGRP作為一種信號作用于膠質細胞，觸發神經元與膠質細胞間的反應，從而促進神經元的存活與修復再生.另有研究發現CGRP對神經細胞具有明顯的營養作用，運動神經元疾病的脊髓和腦細胞核中CGRP免疫反應明顯降低［9］ ，也提示了CGRP對神經細胞具有營養作用.一般認為膠質細胞上存在CGRP受體［10］ ，而CGRP可能是神經和膠質細胞間作用的一種調質，CGRP首先與膠質細胞上的受體結合，刺激膜上的cAMP合成增生，進而激活c-fos基因的表達，c-fos基因又可誘導膠質細胞的纖維酸性蛋白（GFAP）的基因表達，促進GFAP的合成，膠 質細胞還能形成或分泌NGF，促軸突因子、胰島素生長因子（IGF）等多種神經營養因子，這些因子能促進中樞神經和周圍神經軸突的生長和存活，在神經修復再生過程中起重要作用.

完整的神經元和外周組織分別對CGRP的合成產生正反饋和負反饋作用.正常情況下，它們處于一種平衡狀態，當外周神經損傷后，失神經支配的肌肉組織失去了對CGRP合成的抑制作用，而致神經元中CGRP合成增多，有利于神經的再生.CGRP是強烈的血管舒張因子［11］ ，CGRP的增多可增加損傷運動神經元和軸突的血液供應，亦有利于神經的再生，但CGRP的舒血管作用機制尚未明確.另外，CGRP有明顯抗缺血及抗自由基損傷的保護作用，在神經再生中亦不可忽視.激光照射后未損傷側脊髓內CGRP陽性反應細胞亦明顯增多，激光照射治療后機體可有整體效應，其機制需進一步探討.坐骨神經損傷后1d脊髓內CGRP水平即增高，1wk達到較高水平，而第8周時大部分大鼠的肢體功能包括肌力、展趾功能基本恢復時，CGRP仍有較高水平的表達，說明CGRP是神經修復過程中較為敏感的因素，對神經損傷及外周物理因子的刺激反應較為敏感.神經損傷早期，激光照射組與對照組之間無明顯差異，而第2周到第4周激光照射停止后，激光照射組CGRP表達明顯高于對照組，說明神經損傷早期，損傷本身的刺激在CGRP表達中占主導作用，而激光照射作為外界物理因子刺激起次要作用.隨著時間延長，物理因子刺激逐漸發揮主要作用，激光照射組第4wk時CGRP仍有較高的表達說明激光照射停止后其生物學刺激作用仍然存在.CGRP的調控非常復雜，它的基因前體選擇性剪接的不同，在不同組織中表達為降鈣素（CT）或CGRP，低功率激光作為一種物理因子刺激可改變CGRP的表達，但其在CGRP調控中的作用尚需進一步研究.

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