【摘要】 目的 本文對激光掃描共聚焦顯微鏡進行熒光強度的測定條件做了詳細的。 選擇和設置激光掃描共聚焦顯微鏡的各參數，對用間接免疫熒光法檢測改性后的材料表面對人牙齦成纖維細胞分泌細胞外基質纖粘連蛋白FN和I型膠原的進行熒光強度的定量。結果 細胞在材料表面接種后FN的熒光染色強度在四組材料之間差異無顯著性，說明材料表面化學成分的改變對FN的形成沒有明顯影響。但四組材料對I型膠原分泌的影響有差異。結論 選擇和設置適合的激光掃描共聚焦顯微鏡中熒光強度的測定條件，可以真實有效的反映實驗的結果。

關鍵詞 激光掃描共聚焦顯微鏡 熒光強度

research on determine condition of fluorescence intensity in confocal laser scanning microscopy

【Abstract】 Objective To explore the conditions under fluorescence intensity is determined in confocal laser scanning microscopy.Methods The parameters of confocal laser scanning microscopy were set and the effects of these modifications on the response of the fibro-conglutination albumen and type I collage n of human gingival fibrobˉlasts on indirect immunityfluorescence were observed，and the fluorescence intensity of the effects was measured.Reˉsults After the cells grafted on the material surface，the fluorescence dye intensity of the fibro-conglutination albuˉmen had no notable differ ence in materials of the four groups，the alter of the chemistry component of the material surˉface had no notable influence on the formation of the fibro-conglutination albumen.But the effects of the type I collaˉgen were different in materials of the four groups.Conclusion Setting appropriate conditions for the determination of fluorescence intensity in confocal laser scanning microscopy is important in the analysis of the true results of experiˉment.Key words confocal laser scanning microscopy fluorescence intensity

激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning miˉcroscopy，CLSM）是20世紀80年代起來的世界上最先進的分子細胞生物學分析儀器。它是在熒光顯微鏡基礎上加裝了激光掃描裝置，使用紫外或可見激光激發熒光探針，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像，較傳統顯微鏡有著不可比擬的優越性 ［1］ ，已廣泛應用于分子細胞生物學、生、病理學、免疫學、藥理學、遺傳學等領域，成為這些領域新一代強有力的工具，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優越性 。

1 材料與方法 1.1 實驗用樣品 分四組。Ti組:未涂層的對照組;HA組:應用離子束輔助沉積技術在種植體表面沉積羥基磷灰石HA涂層;TCP/HA組:應用離子束輔助沉積技術在種植體表面沉積磷酸三鈣/羥基磷灰石TCP/HA復合涂層;RGD組:應用化學方法在純鈦表面共價接枝生物活性肽RGD（Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸）。樣品規格:直徑10mm，厚2mm的圓盤形，表面粗糙度Ra值均為0.1μm。 1.2 實驗步驟 （1）接種到材料表面的細胞分別培養3、24和48h后，PBS輕輕沖洗3次。（2）4%福爾馬林固定10min，PBS沖洗。（3）0.1%（V/V）Triton X-100滲透5min，PBS沖洗。（4）1%的羊血清阻斷20min。（5）分別用下列抗體37℃孵育1h:①兔抗人FN多克隆抗體（1:30稀釋，Sigma）;②兔抗人I型膠原多克隆抗體（1:30稀釋，Sigma），PBS沖洗3次。對照組一抗用無熒光的兔血清。（6）用TRITC標記的羊抗兔IgG（1:30稀釋，Sigma）37℃孵育1h，PBS沖洗3次。（7）激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica TCS-NT，Germany）取圖，每個試樣隨機選擇30個細胞測量細胞熒光強度。取圖條件:①激發光波長:567nm，②掃描方式:xyz，③物鏡:40倍干鏡（NA為0.75），④激光功率:（20±2）mw，⑤掃描強度:50%，⑥光電 倍增管的增益（PMT）:852，⑦探測針孔:2.02，⑧掃描次數:4。 1.3 統計學方法 實驗結果用SPSS10.0for Windows軟件包處理，單因素方差統計分析，P<0.05時具有統計學差異。 2 結果 2.1 細胞外基質FN的形成 四種材料表面細胞的胞漿內都可見到紅色的FN熒光染色。在細胞核的周圍染色較深，有較強的熒光強度，細胞胞漿的四周熒光強度逐漸降低。說明FN產生的部位位于細胞漿內，其形成量在核周較多，而胞漿的外圍逐漸減少。定量對比四種材料表面細 胞FN的生成量，顯示在檢測的各個階段差異無統計學意義（P>0.05）（見表1）。 表1 材料表面細胞FN生成量的熒光強度比較 （略）注:所有結果組間比較，P>0.05 2.2 I型膠原的形成 在細胞接種后3h，鈦和RGD表面的細胞幾乎沒有I型膠原的分泌;TCP/HA表面可見紅色較強的I型膠原熒光染色區，分布在細胞的胞漿內，細胞核無染色;HA材料表面也可見紅色熒光陽性染色區，但沒有TCP/HA的染色重。熒光強度比較結果顯示，HA和TCP/HA組的熒光強度比Ti和RGD組的大，差異有統計學意義;TCP/HA比HA表面的熒光強度大，差異有統計學意義（P<0.05）;Ti和RGD組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。 細胞培養至24h，可見四種材料表面都有紅色的I型膠原陽性染色，分布在細胞核周圍的胞漿內。定量比較四組間的細胞分泌I型膠原的熒光強度，顯示TCP/HA組比Ti組高，差異有統計學意義（P<0.05），其他各組間差異無統計學意義（P>0.05）。隨著培養時間的延長，各組材料表面細胞分泌的I型膠原含量逐漸增加，至48h，各種材料之間I型膠原的熒光染色強度差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。 表2 三組材料表面細胞I型膠原生成量的熒光強度比較 （略）注: ˇ 為同Ti組相比，P<0.05， ˇˇ 為同Ti組相比，P<0.01; △ 為同HA組相比，P<0.05; ## 為與RGD相比，P<0.01

3 討論 3.1 激光掃描共聚焦顯微鏡的原理及功能 激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光掃描束經照明針孔形成點光源，對標本內焦平面上的每一點掃描，標本上的被照射點，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管（PMT）逐點或逐線接收，迅速在機監視器屏幕上形成熒光圖像，照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的。焦平面的點同時聚焦于照明針孔和探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學橫斷面，克服了普通熒光顯微鏡圖像模糊的缺點。另外在顯微鏡的載物臺上加一個微量步進馬達，可使載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品各個層面移到照明針孔和探測針孔的共焦面上，樣品的不同層面的圖像都能清楚地顯示，成為連續的光切圖像，實現了“光學切片”（Optical sectioning）的目的。激光掃描共焦顯微鏡的功能主要分為兩大類，即圖像靜態采集和動態掃描。其中圖像靜態采集又可分為多熒光探針標記樣品的圖像采集，無損傷連續光學切片圖像的采集，即“細胞CT”，三維圖像重建，熒光強度定量分析。圖像的動態掃描功能可分為xyt、xyzt和xt掃描，即觀察細胞內離子動態變化，熒光漂白恢復（FRAP），熒光能量共振轉移（FRER）等。其中熒光強度的定量是一項非常重要的功能。3.2 熒光強度的定量在生物醫學中的作用 由于多數熒光探針對被標記物的標記均為特異性標記，即熒光探針的亮度即熒光強度可以反映被標記物相對含量的多少。因此利用這一功能可以對 單個細胞或細胞群的溶酶體、線粒體、 DNA、RNA和受體分子含量、成份進行定量測定。還可測定諸如膜電位和配體結合等生化反應程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以準確監測抗原表達，細胞結合和殺傷及定量的形態特性，以揭示諸如腫瘤相關抗原表達的定量信息。由于熒光強度的定量在生物醫學中起著如此重要的作用，因此對進行熒光強度定量的樣品測試就有非常嚴格的要求。進行熒光強度定量的樣品測試條件如下。 3.3 對樣品制備的要求 一個好的開端是成功的一半，樣品制備的好壞更是熒光定量的關鍵之一。對要求進行熒光強度定量的樣品，如來源為組織，應采用冰凍切片，可以減少非特異性的熒光信號。如來源為培養的細胞，為了不將細胞壓扁，蓋玻片與載片之間用甘油與PBS混合液（9:1）封片。甘油還具有抗熒光淬滅的作用。為防止儀器在設定取圖條件時對樣品產生的熒光淬滅發生，在樣本制備時，最好做好各樣品的平行樣。 3.4 儀器各參數的選擇及要求 進行熒光強度定量的樣品，在圖像獲取時，要求各樣品的取圖參數值保持一致。具體相關參數如下。 3.4.1 物鏡（Objective） 物鏡是成像質量關鍵要素之一。熒光進入物鏡的通透量的多少與物鏡的光透射率有關，而物鏡的光透射率與數值孔徑（NA）的4次方成正比，與物鏡的放大倍數的平方成反比，因此應盡量選擇高數值孔徑的物鏡，即通常應選擇油鏡或水鏡。 3.4.2 激光功率（Laser Pwr） 表示激光器的輸出功率，通常激光功率越大，圖像的信噪比越好，但樣品熒光越容易被淬滅，所以激光功率通常要盡可能的小。 3.4.3 激光掃描程度（Scan Str） 設置用來掃描樣品的激光強度占激光器輸出功率的百分比，其大小選擇應