作者：張曉燕 金曉明 劉晨光

【摘要】 目的 探討多柔比星透明質(zhì)酸納米顆粒于體外靶向殺傷口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用。方法 在體外培養(yǎng)的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中分別加入多柔比星濃度為0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L的多柔比星透明質(zhì)酸納米顆粒，利用體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)多柔比星透明質(zhì)酸納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用；多柔比星濃度為5.0、10.0 mg/L時(shí)分別作用0、6、12、24、48 h后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡影響。結(jié)果24、48 h 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)顯示，多柔比星透明質(zhì)酸納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用優(yōu)于游離多柔比星(t=5.78～42.05，P<0.01)。相同濃度多柔比星透明質(zhì)酸納米顆粒細(xì)胞凋亡百分率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高（F=4 200.40、4 775.36，P<0.01），相同作用時(shí)間細(xì)胞凋亡率隨濃度增加而升高（t=12.06～20.08，P<0.05)。結(jié)論 多柔比星透明質(zhì)酸納米顆粒可特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)其殺傷作用，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)殺傷作用增大。 【關(guān)鍵詞】 多柔比星；納米結(jié)構(gòu)；腫瘤，鱗狀細(xì)胞；藥物釋放系統(tǒng);藥物療法 多柔比星（ADM）是臨床常用的抗惡性腫瘤藥，但長(zhǎng)期使用有很強(qiáng)的毒性作用[1]。納米生物材料可大大提高藥物載體的靶向性， 降低藥物的毒副作用[2]。將透明質(zhì)酸（HA）與多柔比星聯(lián)合制成納米顆粒，可通過(guò)HA與透明質(zhì)酸結(jié)合受體（RHAMM）及CD44的特異結(jié)合實(shí)現(xiàn)藥物的特異投放，從而提高藥物的靶向性，降低藥物的毒副作用。本研究旨在探討多柔比星透明質(zhì)酸納米顆粒（AHAN）于體外靶向殺傷口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用。 1 材料與方法 1.1 材料來(lái)源 人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株由上海第九人民醫(yī)院陳萬(wàn)濤教授惠贈(zèng)，AHAN由劉晨光教授惠贈(zèng)。 1.2 儀器與試劑 1640培養(yǎng)基（上海卓康生物科技有限公司），新生小牛血清（中國(guó)杭州四季青生物工程公司），注射用多柔比星（每瓶10 mg，浙江海正藥業(yè)股份有限公司），胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Sigma公司），倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Rainbow酶聯(lián)免疫酶標(biāo)測(cè)定儀（奧地利Tecan公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。 1.3 方法 1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 將口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2孵箱中培養(yǎng)，用胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 1.3.2 AHAN溶液配制 細(xì)胞加藥前取1 mg的AHAN溶于1 mL雙蒸水，浸泡24 h，超聲粉碎顆粒，此時(shí)ADM濃度為156 mg/L，高壓滅菌備用。 1.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及MTT比色法培養(yǎng) 將檢測(cè)細(xì)胞以5×107/L 接種到96 孔培養(yǎng)板中，每孔均為0.1 mL，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合為單層后， 分別加入AHAN（AHAN組）、游離ADM（游離ADM組） 和RPMI 1640工作液(空白對(duì)照組)，AHAN、ADM組按ADM濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L設(shè)4組，每組設(shè)4個(gè)平行組。空白對(duì)照組加等量RPMI 1640工作液。分別培養(yǎng)24、48 h 后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。MTT 法計(jì)算存活率，細(xì)胞存活率＝試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100％，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。 1.3.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將細(xì)胞以1×108/L接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別將5、10 mg/L的HAADMSSL作用于細(xì)胞0、6、12、24、48 h后，將細(xì)胞用2.5 g/L胰酶EDTA消化、離心收集，0.01 mol/L PBS （pH 7.4）洗2次，3 000 r/min 離心5 min，體積分?jǐn)?shù)0.70冷乙醇固定細(xì)胞，加含RNA酶PI染液4 ℃作用30 min，過(guò)網(wǎng)，調(diào)細(xì)胞濃度至109/L，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[3]統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 各組細(xì)胞形態(tài)的變化 加藥24 h后，空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化；游離ADM組和AHAN組均可見(jiàn)部分鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞收縮，細(xì)胞變小變圓，有突起相互牽連，在細(xì)胞表面出現(xiàn)多數(shù)暗色顆粒，AHAN組同時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞散在脫落。加藥48 h后，游離ADM組可見(jiàn)細(xì)胞多數(shù)收縮， AHAN組可見(jiàn)細(xì)胞幾乎完全脫落，呈散在存在。 2.2 各組細(xì)胞存活率比較 培養(yǎng)24、48 h兩組相同濃度細(xì)胞存活率比較差異有顯著性(t=5.78～42.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。 2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 相同濃度的AHAN細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高（F=4 200.40、4 775.36，P<0.01），濃度為5.0、10.0 mg/L作用0 h兩組間細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異（t=0.20，P>0.05），分別作用6、12、24、48 h兩組凋亡率差異有顯著性（t=12.06～20.08，P<0.05）。見(jiàn)表2。 表1 兩組培養(yǎng)24、48 h細(xì)胞存活率比較（略） 表2 不同濃度的AHAN對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡率的影響（略）

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