作者：張曉燕 金曉明 劉晨光

【摘要】 目的 探討多柔比星透明質酸納米顆粒于體外靶向殺傷口腔鱗狀細胞癌的作用。方法 在體外培養的口腔鱗狀細胞癌細胞中分別加入多柔比星濃度為0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L的多柔比星透明質酸納米顆粒，利用體外細胞毒實驗四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測多柔比星透明質酸納米顆粒對腫瘤細胞的靶向殺傷作用；多柔比星濃度為5.0、10.0 mg/L時分別作用0、6、12、24、48 h后，利用流式細胞儀檢測其對腫瘤細胞凋亡影響。結果24、48 h 細胞毒實驗顯示，多柔比星透明質酸納米顆粒對腫瘤細胞的殺傷作用優于游離多柔比星(t=5.78～42.05，P<0.01)。相同濃度多柔比星透明質酸納米顆粒細胞凋亡百分率隨時間延長而升高（F=4 200.40、4 775.36，P<0.01），相同作用時間細胞凋亡率隨濃度增加而升高（t=12.06～20.08，P<0.05)。結論 多柔比星透明質酸納米顆粒可特異性識別腫瘤細胞，并實現其殺傷作用，而且隨時間延長殺傷作用增大。 【關鍵詞】 多柔比星；納米結構；腫瘤，鱗狀細胞；藥物釋放系統;藥物療法 多柔比星（ADM）是臨床常用的抗惡性腫瘤藥，但長期使用有很強的毒性作用[1]。納米生物材料可大大提高藥物載體的靶向性， 降低藥物的毒副作用[2]。將透明質酸（HA）與多柔比星聯合制成納米顆粒，可通過HA與透明質酸結合受體（RHAMM）及CD44的特異結合實現藥物的特異投放，從而提高藥物的靶向性，降低藥物的毒副作用。本研究旨在探討多柔比星透明質酸納米顆粒（AHAN）于體外靶向殺傷口腔鱗狀細胞癌的作用。 1 材料與方法 1.1 材料來源 人口腔鱗狀細胞癌細胞株由上海第九人民醫院陳萬濤教授惠贈，AHAN由劉晨光教授惠贈。 1.2 儀器與試劑 1640培養基（上海卓康生物科技有限公司），新生小牛血清（中國杭州四季青生物工程公司），注射用多柔比星（每瓶10 mg，浙江海正藥業股份有限公司），胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍（MTT，Sigma公司），倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Rainbow酶聯免疫酶標測定儀（奧地利Tecan公司），流式細胞儀（美國BD公司）。 1.3 方法 1.3.1 細胞的培養 將口腔鱗狀細胞癌細胞接種于含體積分數0.10小牛血清的RPMI 1640 培養基中，置于37 ℃、體積分數0.05的CO2孵箱中培養，用胰酶消化傳代。取對數生長期的細胞用于實驗。 1.3.2 AHAN溶液配制 細胞加藥前取1 mg的AHAN溶于1 mL雙蒸水，浸泡24 h，超聲粉碎顆粒，此時ADM濃度為156 mg/L，高壓滅菌備用。 1.3.3 細胞形態學觀察及MTT比色法培養 將檢測細胞以5×107/L 接種到96 孔培養板中，每孔均為0.1 mL，待細胞生長融合為單層后， 分別加入AHAN（AHAN組）、游離ADM（游離ADM組） 和RPMI 1640工作液(空白對照組)，AHAN、ADM組按ADM濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L設4組，每組設4個平行組。空白對照組加等量RPMI 1640工作液。分別培養24、48 h 后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態的改變。MTT 法計算存活率，細胞存活率＝試驗組吸光度值/對照組吸光度值×100％，測定波長為570 nm。 1.3.4 流式細胞儀測定細胞凋亡率 將細胞以1×108/L接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別將5、10 mg/L的HAADMSSL作用于細胞0、6、12、24、48 h后，將細胞用2.5 g/L胰酶EDTA消化、離心收集，0.01 mol/L PBS （pH 7.4）洗2次，3 000 r/min 離心5 min，體積分數0.70冷乙醇固定細胞，加含RNA酶PI染液4 ℃作用30 min，過網，調細胞濃度至109/L，流式細胞術檢測細胞凋亡率。 1.4 統計學處理 采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[3]統計分析軟件對數據進行統計學處理，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05認為差異具有統計學意義。 2 結果 2.1 各組細胞形態的變化 加藥24 h后，空白對照組細胞形態無明顯變化；游離ADM組和AHAN組均可見部分鱗狀細胞癌細胞收縮，細胞變小變圓，有突起相互牽連，在細胞表面出現多數暗色顆粒，AHAN組同時可見細胞散在脫落。加藥48 h后，游離ADM組可見細胞多數收縮， AHAN組可見細胞幾乎完全脫落，呈散在存在。 2.2 各組細胞存活率比較 培養24、48 h兩組相同濃度細胞存活率比較差異有顯著性(t=5.78～42.05，P<0.01)。見表1。 2.3 流式細胞術檢測 相同濃度的AHAN細胞凋亡率隨時間延長而升高（F=4 200.40、4 775.36，P<0.01），濃度為5.0、10.0 mg/L作用0 h兩組間細胞凋亡率無顯著差異（t=0.20，P>0.05），分別作用6、12、24、48 h兩組凋亡率差異有顯著性（t=12.06～20.08，P<0.05）。見表2。 表1 兩組培養24、48 h細胞存活率比較（略） 表2 不同濃度的AHAN對口腔鱗狀細胞癌細胞凋亡率的影響（略）

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