作者：杜崇磊杜偉 汪冰 豐偉悅 王卓 趙宇亮

【摘要】 氧化鐵納米粒子是一種新型的磁功能材料，被廣泛應(yīng)用于生物、材料以及環(huán)境等眾多領(lǐng)域。本文介紹了超順磁氧化鐵納米粒子的制備方法，比較了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)；評(píng)述了磁性氧化鐵納米粒子在細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸分離及生物檢測(cè)中的應(yīng)用，對(duì)多功能復(fù)合磁性氧化鐵納米粒子的構(gòu)建， 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有的指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】 超順磁性氧化鐵納米粒子； 制備； 生物分離； 生物檢測(cè)； 評(píng)述

Abstract Superparamagnetic iron oxide nanomaterials have been widely used in the biotechnology， materials and environmental chemistry， etc. In this review， the synthesis methods of superparamagnetic iron oxide， the merits and defects of these methods， and their application in cell， protein， nucleic acid separation and bioassay were reviewed.

Keywords Superparamagnetic iron oxide nanoparticles; Synthesis; Bioseparation； Ｂioassay; Review

1 引 言

磁性納米粒子是近年來發(fā)展起來的一種新型材料，因其具有獨(dú)特的磁學(xué)特性，如超順磁性和高矯頑力，在生物分離和檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景[1]。同時(shí)，因磁性氧化鐵納米粒子具有小尺寸效應(yīng)、良好的磁導(dǎo)向性、生物相容性、生物降解性和活性功能基團(tuán)等特點(diǎn)[2～４]， 在核磁共振成像、靶向藥物、酶的固定、免疫測(cè)定等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景[５～７]。但由于其較高的比表面積，強(qiáng)烈的聚集傾向，所以通常對(duì)其表面進(jìn)行修飾，降低粒子的表面，能得到分散性好、多功能的磁性納米粒子。對(duì)磁性納米粒子的表面進(jìn)行特定修飾，如果在修飾后的粒子上引入靶向劑、藥物分子、抗體、熒光素等多種生物分子，可以改善其分散穩(wěn)定性和生物相容性， 以實(shí)現(xiàn)特定的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。此外，適當(dāng)?shù)谋砻嫘揎椈虮砻婀δ芑€可以調(diào)節(jié)磁性納米粒子表面的反應(yīng)活性[８]，從而使其應(yīng)用在細(xì)胞分離、蛋白質(zhì)純化、核酸分離和生物檢測(cè)等領(lǐng)域。本文介紹了磁性氧化鐵納米粒子的制備方法， 比較了各種制備方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)其在生物分離及檢測(cè)中應(yīng)用的最新進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

2 磁性氧化鐵納米粒子的合成方法

磁性納米粒子的制備是其應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前已發(fā)展了多種合成和制備方法，如共沉淀法、水熱合成法、溶膠凝膠法和微乳液法等，上述方法均可制備高分散、粒度分布均勻的納米粒子，并能方便地對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)修飾，這些方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)見表1。

在這些合成方法當(dāng)中，共沉淀法是水相合成氧化鐵納米粒子最常用的方法。該方法制備的磁性納米顆粒具有粒徑小，分散均勻，高度生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，但制得的顆粒存在形狀不規(guī)則，結(jié)晶差等缺點(diǎn)。通過在反應(yīng)體系中加入檸檬酸，可得到形狀規(guī)則、分散性好的納米粒子。利用這種方法合成的磁性納米材料被廣泛應(yīng)用在生物化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[9]。微乳液法制備納米粒子，產(chǎn)物均勻、單分散，可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，通過控制膠束、結(jié)構(gòu)、極性等，可望從分子規(guī)模來控制粒子的大小、結(jié)構(gòu)、特異性等。微乳液合成的磁性納米粒子僅溶于有機(jī)溶劑，其應(yīng)用受到限制。通常需要在磁性納米粒子的表面修飾上親水分子，使其溶于水，從而能應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

熱分解法是有機(jī)相合成氧化鐵納米粒子最多也是最穩(wěn)定的方法。利用熱分解法制備的納米Fe3O4顆粒產(chǎn)物具有好的單分散性，且呈疏水性，可以長(zhǎng)期穩(wěn)定地分散于非極性有機(jī)溶劑中。該方法合成的氧化鐵納米粒子雖然具有粒徑均一的特點(diǎn)，但必須在其表面偶聯(lián)親水性及生物相容性好的生物分子或制備成核殼結(jié)構(gòu)，才可用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。表1 磁性氧化鐵納米粒子的制備方法（略）

此外，綠色化學(xué)和生物方法合成氧化鐵納米粒子也備受關(guān)注[28，29]。磁性氧化鐵納米粒子除具有的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等納米粒子基本特性外，它同時(shí)還具有超順磁特性、類酶催化特性和生物相容性等特殊性質(zhì)，因此在醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用引起了人們的廣泛興趣。

3 磁性氧化鐵納米材料在生物分離與生物檢測(cè)的應(yīng)用 3.1 磁性氧化鐵納米材料在生物分離的應(yīng)用

磁性氧化鐵納米粒子可以通過外界磁場(chǎng)來控制納米粒子的磁性能，從而達(dá)到分離的目的，如細(xì)胞分離[30，31]、蛋白分離[32] 和核酸分離[33]等。此外磁性氧化鐵納米粒子由于兼有納米、磁學(xué)和類酶催化活性等性能，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)被檢測(cè)物的分離和富集，而且能夠使檢測(cè)信號(hào)放大，在生物分析領(lǐng)域也都具有很好的應(yīng)用前景[34，35]。磁性納米粒子（MNP）能夠應(yīng)用于這些領(lǐng)域主要基于它的表面化學(xué)修飾，包括非聚合物有機(jī)固定、聚合物有機(jī)固定、無機(jī)分子固定及靶向配體修飾等[36]（圖1）。納米粒子表面功能化修飾是目前研究的熱點(diǎn)。

3.1.1 磁性氧化鐵納米材料在細(xì)胞分離方面的應(yīng)用 細(xì)胞分離技術(shù)的目的是快速獲得所需目標(biāo)細(xì)胞。傳統(tǒng)細(xì)胞分離技術(shù)主要根據(jù)細(xì)胞的大小、形態(tài)以及密度的差異進(jìn)行分離，如采用微濾、超濾以及超離心等方法。這些方法操作簡(jiǎn)單，但是特異性差，而且存在純度不高、制備量偏小、影響細(xì)胞活性等缺點(diǎn)，因此未能被廣泛地用于細(xì)胞的純化研究[37]。近年來，隨著對(duì)磁性納米粒子研究的深入，人們開始利用磁性納米粒子來分離細(xì)胞[38，39]。如磁性氧化鐵納米粒子在其表面接上具有生物活性的吸附劑或配體（如抗體、熒光物質(zhì)、外源凝結(jié)素等），利用它們與目標(biāo)細(xì)胞的特異性結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下將細(xì)胞分離、分類以及對(duì)其種類、數(shù)量分布進(jìn)行研究。張春明等[40]運(yùn)用化學(xué)連接方法將單克隆抗體CD133連接到SiO2/Fe3O4復(fù)合粒子的表面得到免疫磁性Fe3O4納米粒子，利用它分離出單核細(xì)胞和CD133細(xì)胞。經(jīng)培養(yǎng)后可以看出，分離出來的CD133細(xì)胞與單核細(xì)胞一樣，具有很好的活性，能夠正常增殖形成集落，并且在整個(gè)分離過程中對(duì)細(xì)胞的形態(tài)以及活性沒有明顯的毒副作用，這與Kuhara等[30]]報(bào)道的采用磁分離技術(shù)分離CD19+和CD20+細(xì)胞的結(jié)果一致。Chatterjee等[39]采用外源凝結(jié)素分別修飾聚苯乙烯包被的磁性Fe3O4微球和白蛋白磁性微球，利用凝結(jié)素與紅細(xì)胞良好的結(jié)合能力，快速、高效的分離了紅細(xì)胞。此外，磁性粒子在分離癌細(xì)胞和正常細(xì)胞方面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已獲得成功。

3.1.2 磁性氧化鐵納米材料在蛋白質(zhì)和核酸分離中的應(yīng)用

利用傳統(tǒng)的生物學(xué)技術(shù)（如溶劑萃取技術(shù)等）來分離蛋白質(zhì)和核酸程序非常繁雜，而磁分離技術(shù)是分離蛋白、核酸及其他生物分子便捷而有效的方法。目前在外磁場(chǎng)作用下，超順磁性氧化鐵納米粒子已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸的分離。 Liu等[41]利用聚乙烯醇等表面活性劑存在下制備出共聚磁性高分子微球，表面用乙二胺修飾后用于分離鼠腹水抗體，得到很好的分離效果。Xu等[42]在磁性氧化鐵納米粒子表面偶聯(lián)多巴胺分子，用于多種蛋白質(zhì)的分離純化。多巴胺分子具有二齒烯二醇配體，它可以與氧化鐵納米粒子表面配位不飽和的Fe原子配位，形成納米顆粒多巴胺復(fù)合物，此復(fù)合物可以進(jìn)一步偶聯(lián)次氨基三乙酸分子（NTA），NTA分子可特異螯合Ni＋，對(duì)于具有6×His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)的分離純化方面表現(xiàn)出很高的專一性。Liu等[43]用硅烷偶聯(lián)劑（AEAPS）對(duì)核殼結(jié)構(gòu)的SiO2/Fe2O3復(fù)合粒子的表面進(jìn)行處理，研究復(fù)合磁性粒子對(duì)牛血清白蛋白（BSA）的吸附情況，結(jié)果表明BSA與磁性復(fù)合粒子之間是通過化學(xué)鍵作用被吸附的，復(fù)合粒子對(duì)BSA的最大吸附量達(dá)86 mg/g，顯示出在白蛋白的分離和固定上有很大的應(yīng)用潛力。Herdt等[44]利用羧基修飾的吸附/解離速度快的核殼型（Fe3O4/PAA）磁性納米顆粒與Cu2+亞氨基二乙酸（IDA）共價(jià)交聯(lián)，通過Cu2+與組氨酸較強(qiáng)的親和能力實(shí)現(xiàn)了組氨酸標(biāo)記蛋白的選擇性分離，分離過程如圖2所示。 磁性納米粒子也是核酸分子分離的理想載體[4５]。DNA/mRNA含有單一堿基錯(cuò)位，它們的富集和分離在人類疾病診斷學(xué)、基因表達(dá)研究方面有著至關(guān)重要的作用。Zhao等[4６]合成了一種磁性納米基因捕獲器，用于富集、分離、檢測(cè)痕量的DNA/mRNA分子。這種材料以磁性納米粒子為核，包覆一層具有生物相容性的SiO2保護(hù)層，表面再偶聯(lián)抗生素蛋白維生素H分子作為DNA分子的探針，可以將10－15 mol/L DNA/mRNA有效地富集，并能實(shí)時(shí)監(jiān)控產(chǎn)物。Tayor等[4７]用硅酸鈉水解法、正硅酸乙酯水解法制備SiO2/Fe2O3磁性納米粒子并對(duì)DNA進(jìn)行了分離。結(jié)果表明，SiO2功能化的Fe2O3磁性納米粒子對(duì)DNA的吸附分離效果明顯好于單獨(dú)Fe2O3磁性納米粒子的分離效果，但是其吸附機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

3.2 磁性氧化鐵納米材料在生物檢測(cè)中的應(yīng)用

3.2.1 基于磁學(xué)性能的生物檢測(cè)

磁性氧化鐵納米粒子因其特有的磁導(dǎo)向性、小尺寸效應(yīng)及其偶聯(lián)基團(tuán)的活性，兼有分離和富集地作用，使其在生物檢測(cè)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。當(dāng)檢測(cè)目標(biāo)為低含量的蛋白分子時(shí)，不能通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)其信號(hào)進(jìn)行放大，而磁微球與有機(jī)染料或量子點(diǎn)熒光微球結(jié)合可以對(duì)某些特異性蛋白、細(xì)胞因子、抗原和核酸等進(jìn)行多元化檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的作用。Yang等[4８]采用一對(duì)分子探針分別連接熒光光學(xué)條碼（彩色）和磁珠（棕色），對(duì)DNA（頂端鑲板）和蛋白質(zhì)（底截鑲板）生物分子進(jìn)行目標(biāo)分析（圖3）。如果目標(biāo)DNA序列或蛋白存在，它將與兩個(gè)磁珠結(jié)合一起，形成了一個(gè)三明治結(jié)構(gòu)，經(jīng)過磁選，光學(xué)條碼可以在單磁珠識(shí)別目標(biāo)水平下，通過分光光度計(jì)或是在流式細(xì)胞儀讀出。通過此方法檢測(cè)目標(biāo)分子是基于數(shù)百萬個(gè)熒光基團(tuán)組成的微米尺寸光學(xué)條碼信號(hào)的擴(kuò)增而檢測(cè)出來，其基因和蛋白的檢出限可達(dá)到amol/L量級(jí)，甚至更低。

Nam等［４９］利用多孔微粒法（每個(gè)微粒可填充大量條形碼DNA）和金納米微粒為基礎(chǔ)的比色法生物條形碼檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)了人白細(xì)胞介素2（IL2），檢出限可達(dá)到30 amol/L，比普通的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的靈敏度高3個(gè)數(shù)量級(jí)。Oh等 [５０]利用熒光為基礎(chǔ)的生物條形碼放大方法檢測(cè)了前列腺特異性抗原（PSA）的水平，其檢出限也低于300 amol/L，而且實(shí)現(xiàn)了快速檢測(cè)。

在免疫檢測(cè)中，磁性納米粒子作為抗體的固相載體，粒子上的抗體與特性抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，在磁力作用下，使特異性抗原與其它物質(zhì)分離，克服了放免和酶聯(lián)免疫測(cè)定方法的缺點(diǎn)。這種分離具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。Yang等[5１]通過反相微乳液法制備了粒徑很小的SiO2包覆的Fe3O4磁性納米粒子，生物分子通過誘導(dǎo)這些高單分散的磁性納米粒子可用于酶的固定和免疫檢測(cè)。Lange等[5２]采用直接或三明治固相免疫法（生物素基化抗IgG抗體和共軛連接鏈霉素的磁性納米粒子組成三明治結(jié)構(gòu)）和超導(dǎo)量子干涉法（SQUID），研究它們?cè)诖_定抗原、抗體相互作用免疫檢測(cè)中的應(yīng)用，結(jié)果表明特異性鍵合的磁性納米顆粒的馳豫信號(hào)大小依賴于抗原（人免疫球蛋白G，IgG）的用量，這種磁弛豫(Magnetic relaxation)免疫檢測(cè)方法得到的結(jié)果與廣泛使用的ELISA方法的結(jié)果相當(dāng)。

因磁性納米粒子獨(dú)特的性能，在生物傳感器上也有潛在的應(yīng)用前景。Fan等［５３］在磁珠上偶聯(lián)被檢測(cè)物的一級(jí)抗體，在金納米顆粒上連接二級(jí)抗體，兩者反應(yīng)后，利用HClNaClBr2將Au氧化為Au3+，催化發(fā)光胺（Luminol）化學(xué)發(fā)光，人免疫球蛋白G（IgG）的檢出限可達(dá)2 × 10－10 mol/L ，實(shí)現(xiàn)了磁性納米顆粒化學(xué)發(fā)光免疫結(jié)合的方法對(duì)IgG進(jìn)行生物傳感分析（圖4）。

3.2.2 類酶催化特性在生物檢測(cè)中的應(yīng)用

Cao等[5４]發(fā)現(xiàn)Fe3O4磁性納米粒子能夠催化H2O2氧化3，3'，5，5'四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、3，3'二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）和鄰苯二胺（OPD），使其發(fā)生顯色反應(yīng)，具有類辣根過氧化物酶（HRP）活性（圖5），而且其催化活性比相同濃度的辣根過氧化物酶高40倍。并且Fe3O4磁性納米粒子可以運(yùn)用磁分離手段進(jìn)行重復(fù)性利用，顯著降低了生物檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)成本，利用此特性可進(jìn)行多種生物分子的檢測(cè)。 利用葡萄糖氧化酶（GOx）與Fe3O4磁性納米粒子催化葡萄糖的反應(yīng)(見式（1）和(2))，通過比色法檢測(cè)葡萄糖，其檢測(cè)的靈敏度達(dá)到5×10－5 ～ 1×10－3 mol/L 。由于Fe3O4磁性納米粒子制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、活性高，成本低，因而比普通酶更有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，這也為葡萄糖的檢測(cè)提供了高靈敏度和選擇性的分析方法，在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用上展現(xiàn)了巨大的潛能，為糖尿病人疾病的診斷提供了快速、靈敏的檢測(cè)方法。然而要提高檢測(cè)靈敏度，合成催化效率高的Fe3O4磁性納米粒子及多功能磁性納米粒子是關(guān)鍵。Peng等[5６]用電化學(xué)方法比較了不同尺寸Fe3O4納米粒子的催化活性發(fā)現(xiàn)，隨著尺寸的變小，磁性納米粒子的催化活性變高。Wang等[5７]制備的單分散啞鈴型PtFe3O4納米粒子，由于本身尺寸和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可更大限度地提高催化活性。本研究組已經(jīng)合成了分散性好和磁性高的氧化鐵納米粒子并對(duì)其進(jìn)行了表征，利用其磁學(xué)和催化特性，已開展了葡萄糖等生物分子的檢測(cè)，該方法的檢出限達(dá)到1 μmol/L，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和成本低等優(yōu)點(diǎn)[5８]。

總之，F(xiàn)e3O4磁性氧化鐵納米粒子不但具有顯著的超順磁性，而且具有類辣根過氧化物酶催化特性，可通過使用過氧化物敏感染料，設(shè)計(jì)了一系列（如乙肝病毒表面抗原等）的免疫檢測(cè)模型[59]，因此超順磁性納米粒子在生物分離和免疫檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 語

隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，磁性氧化鐵納米粒子的開發(fā)及其在生物醫(yī)學(xué)、生物分析、生物檢測(cè)等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用已經(jīng)越來越受到重視，但同時(shí)也面臨很多挑戰(zhàn)和問題。（1）構(gòu)建并制備尺寸小、粒徑均一、分散性和生物相容性好及催化性能高的多功能磁性納米粒子；（2）根據(jù)被檢測(cè)生物分子的特點(diǎn)設(shè)計(jì)多功能磁性氧化鐵納米粒子，實(shí)現(xiàn)高靈敏度、特異性檢測(cè)；（3）利用納米氧化鐵顆粒作為分子探針進(jìn)行實(shí)時(shí)、在線、原位、活體和細(xì)胞內(nèi)生物分子的檢測(cè)。這些問題不僅是納米材料在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用需要解決的難點(diǎn)，也是目前其進(jìn)行生物分子檢測(cè)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。