作者：熊志剛 李建平 唐麗 陳志強

【摘要】 通過交聯劑將葡萄糖氧化酶（GOD）固定在Fe3O4磁性納米粒子上，在磁力作用下將該磁性復合粒子修飾在石蠟碳糊電極（SPCE）表面，制成易更新酶電極。GOD催化氧化葡萄糖生成過氧化氫，并使魯米諾產生電致化學發光(ECL)，據此首次構建了易更新型電致化學發光葡萄糖傳感器。其電致發光強度與葡萄糖濃度在1×10－5～1.0×10－2 mol/L范圍內呈線性關系，線性回歸方程I＝65.4374C+23.9017（r=0.9987）； 檢出限為1.0 μmol/L。此傳感器響應快， 穩定性高， 表面易更新，已用于測定人血清中葡萄糖的含量。

【關鍵詞】 電致化學發光; 磁性納米粒子； 葡萄糖氧化酶； 魯米諾； 化學修飾電極

Abstract A novel NanoFe3O4 particles biosensor for glucose based on luminol electrochemiluminescence (ECL) is presented. Glucose oxidase (GOD) was covalently crosslinked to the surface of synthesized magnetic nanoFe3O4 particles. Then the composite particles Fe3O4/GOD was adhered to solid paraffin carbon paste electrode by magnetic force to fabricate a working electrode. Hydrogen peroxide was produced by enzymatic reaction of GOD and ECL could be obtained by the reaction between luminol and hydrogen peroxide to construct the renewable glucose biosensor. There was a linear relationship between ECL and glucose concentration in the ranges of 1×10－5－1.0×10－2 mol/L with a regression equation of I＝65.4374C+23.9017(r=0.9987)， and the detection limit is 1 μmol/L. The ECL biosensor has showed short response time and high stability， and the electrode surface was renewable easily. The proposed biosensor has been applied to the determination of glucose in plasma samples.

Keywords Electrochemiluminescence; Magnetic nanoparticles; Glucose oxidase; Luminol; Chemically modified electrode

1 引 言

電致化學發光（ECL)是在化學發光的基礎上，結合電極反應發展起來的一種化學發光法[1～3]。利用葡萄糖氧化酶（GOD）催化氧化葡萄糖生成H2O2可以構建葡萄糖ECL傳感器。在ECL葡萄糖傳感器研究中，GOD的固定方法是一個重要課題。常用的酶固定化方法有吸附法[4]、包埋法[5]、共價鍵合法及交聯法[6，7]，電化學聚合法［８］。這些方法制備ECL酶傳感器過程煩瑣、復雜，電極表面敏感膜不易更新。 在酶傳感器中采用納米材料為載體，不僅可以增加酶的固定量和穩定性，而且還可以提高酶的催化活性，進而提高酶電極的響應靈敏度[９]。Fe3O4磁性納米粒子具有納米粒子的諸多優點，又具有非常好的生物相容性，在外加磁力的作用下能非常方便地實現電極敏感膜的更新，故在酶傳感器研究中得到了廣泛應用[１０～1７]。但是在ECL葡萄糖傳感器中，使用Fe3O4磁性納米粒子固定GOD還未見報道。本研究通過交聯劑將GOD共價固定在Fe3O4磁性納米粒子表面，再通過磁力將此固載酶的磁性納米粒子修飾在SPCE表面，從而制成了易更新的酶傳感器，并用于葡萄糖的ECL分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

MPIE型電致化學發光分析系統（西安瑞邁分析儀器有限公司）; M1703型紅外光譜儀（PerkinElmer公司）; 三電極系統：工作電極為自制的磁性納米粒子固定酶修飾電極（GOD/Fe3O4/SPCE/CME），參比電極為Ag/AgCl飽和KCl電極，鉑絲為對電極；Bransonic200超聲清洗儀(德國Branson Ultraschall公司)；pHS2C型精密酸度計（上海雷磁精密儀器有限公司）。

3氨基丙基三乙氧基硅烷(APS，98%， Alfa Aesar公司）；葡萄糖氧化酶(GOD，120 U/mg，Sigma公司）；標準葡萄糖儲備液，放置過夜后使用，保存于4 ℃冰箱中。魯米諾(＞98%，Fluka公司）; 戊二醛(25%，上海化學試劑廠）；其它試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水(18.2 MΩ·cm)。

2.2 酶傳感器的制作

2.2.1 固體石蠟碳糊電極的制作

2.2.2 磁性納米粒子的制備、氨基化和葡萄糖氧化酶修飾

按照n(Fe2+)∶n(Fe3+) = 1∶1.75稱取適量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O，溶于水中。攪拌下快速加入適量 2.0 mol/L NaOH溶液，調pH值至11.0，室溫下攪拌0.5 h，迅速升溫到75 ℃，熟化0.5 h，整個過程都在氮氣的保護下進行，得黑色懸浮液。超聲15 min，磁鐵分離不溶物，用水洗滌至溶液呈中性。在75 ℃下真空干燥，得粉末，4 ℃下密閉保存在。 取20 mL乙醇，加入50 mg Fe3O4納米粒子粉末，超聲分散，之后加入0.2 mL 3氨基丙基三乙氧基硅烷（98%），在氮氣的保護下，25 ℃攪拌12 h制得氨基化的磁性納米粒子，用無水乙醇、水超聲清洗后定容至20 mL備用。

取2.0 mL上述溶液于5 mL試管中，晾干，再于試管中加入2.0 mL 0.25%戊二醛，混旋30 s后，放入4 ℃冰箱冷藏1 h，之后水洗并晾干，再加20 g/L GOD溶液2.0 mL，于4 ℃冰箱中保存12 h，制得GOD修飾的磁性粒子溶液（GOD/ Fe3O4）。圖1為磁性納米粒子固定葡萄糖氧化酶的示意圖。 2.2.3 自組裝磁性納米復合粒子修飾電極

SPCE電極面朝上，用磁鐵吸住電極上端鐵芯，滴加15 μL GOD/Fe3O4粒子在電極表面，制得酶修飾電極（GOD/Fe3O4/SPCE/CME）。測定時將電極面對準光電倍增管檢測方向。每次更新電極時，移去磁鐵，水洗去磁性復合粒子，之后重復上述過程以更新電極。

2.3 ECL傳感器原理和實驗方法

ECL傳感器的原理如圖2。GOD/Fe3O4復合磁性納米粒子通過外加磁場而修飾在SPCE電極表面。此時，溶液中的葡萄糖與溶解氧發生GOD酶促反應，生成H2O2。同時，溶液中的魯米諾在修飾電極表面發生氧化，魯米諾氧化物與H2O2發生ECL反應。GOD/Fe3O4復合磁性納米粒子的存在促進了魯米諾的氧化和H2O2生成。在本實驗中，室溫下，將10 mL含一定濃度的葡萄糖的0.5 mmol/L魯米諾 0.1 mol/L硼酸鈉緩沖溶液(pH=8.0)轉至石英燒杯中，然后采用三電極系統進行測試，并測定ECL的強度。掃描范圍為0.2～1.4 V(vs. SCE)，掃速為50 mV/s。光電倍增管高壓600 V，采樣速率10 T/S，放大倍數3，測量時間60 s。SPCE不用時置于冰箱中4 ℃下保存。

３ 結果與討論

3.1 Fe3O4納米粒子的表征

３．１．１ Fe3O4納米粒子粒度分析

用激光散射儀（英國Malvern公司）測定Fe3O4納米粒子粒徑。從圖3可見，本實驗所制備的Fe3O4磁性粒子粒徑主要分布在12～22 nm之間。說明磁性納米粒子已經達到納米級，且粒徑分布較為集中，因此，可用于后續實驗。

3.１．2 Fe3O4納米粒子的氨基功能化表征

用紅外光譜表征Fe3O4粒子表面氨基化修飾前后的變化。由圖4可見，在Fe3O4粒子表面功能化修飾了氨基基團，Fe3O4粒子與氨基化Fe3O4粒子都具有Fe3O4粒子特征峰（583.235 cm－1）；氨基化Fe3O4粒子具有SiO的伸縮振動特征峰（1409.675 cm－1）和氨基彎曲振動特征峰（1638.335 cm－1）。

3.１．3 酶復合磁性粒子的磁力測定

用振動樣品磁強計(PAR115型)對移去磁鐵而洗脫獲得的酶復合磁性粒子進行磁力測量。復合粒子矯頑力較低，同時未見明顯的剩磁和磁滯現象，其比飽和磁化強度σ僅為42.1 emu/g（圖5）。由此可見，Fe3O4 /GOD復合粒子具有較強超順磁性即在外磁場存在下有磁性，外撤除磁場則磁性消失，故可用于磁性分離。

3.２ 酶電極的ECL行為

Fe3O4/GOD（a）和Fe3O4（b）粒子分別修飾的SPCE，在10 mL含0.1 mmol/L魯米諾和1.0 mmol/L葡萄糖+0.1 mol/L硼酸鈉緩沖溶液(pH= 8.0)中進行CV實驗所得到ECL圖(見圖6)。實驗條件：電位掃速為50 mV/s，掃描范圍為0.2～1.4 V，采樣速率10 T/S，放大倍數3。由圖6可見，修飾在電極表面的Fe3O4粒子表面成功地共價固定了GOD，從而催化氧化葡萄糖生成魯米諾ECL所需的H2O2。

3.3 緩沖液種類、pH值和溫度的影響

研究了3種緩沖液: 0.1 mol/L硼酸鈉、0.1 mol/L HAcNaAc和PBS(pH=8.0)作為支持電解質的影響。結果表明，0.1 mol/L硼酸鈉緩沖溶液中ECL響應最高。

魯米諾的ECL反應需在弱堿性條件下進行，考慮到葡萄糖氧化酶的生物活性受pH值影響較大，本研究考察了pH在7.0～9.5時ECL強度的變化。其中魯米諾濃度為0.1 mmol/L，葡萄糖濃度為1.0 mmol/L。當pH=8.0時，魯米諾的ECL強度最大，本實驗選取pH=8.0。

酶的催化活性受溫度影響較大。本實驗用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器控制水浴溫度，考察了20～60 ℃范圍內酶電極的電流響應。當溫度達到40 ℃時，響應最大。綜合考慮溫度對葡萄糖氧化酶電極壽命的影響，本實驗均在室溫25 ℃下進行。

3.４ 魯米諾濃度的影響

本實驗考察了魯米諾的濃度在0.01～1.2 mmol/L范圍內對ECL強度的影響（圖7）。由圖7可知，隨著魯米諾的濃度由0.01 mmol/L增大到0.5 mmol/L時，溶液的ECL強度快速增大，之后趨于平穩飽和。因此，實驗中魯米諾的濃度為0.5 mmol/L。

3.５ 葡萄糖的分析

取10 mL石英小燒杯，加入含一系列不同濃度的葡萄糖0.1 mol/L硼酸鈉緩沖溶液(pH= 8.0)10 mL，此時魯米諾濃度為0.5 mmol/L，按上述方法測定ECL的強度（圖8）。葡萄糖在1×10－5～1.0×10－2 mol/L濃度范圍內與ECL強度呈良好的線性關系：I＝65.4374C+23.9017， r=0.9987； 檢出限為1 μmol/L； 酶電極的響應時間約為10 s。

3.６ 葡萄糖傳感器的重現性、穩定性和選擇性

通過移除ECL葡萄糖傳感器上方的磁鐵，用水沖SPCE電極表面，在0.5 mol/L HCl中清洗0.5 min，從而去除磁性復合粒子。重復2.2.2節的修飾過程，可實現磁性復合粒子的更新。每次電極更新后對1.0 mmol/L的葡萄糖進行測定，其RSD=3.9%（n=5）。而對于5批次相同條件下制得的傳感器，其RSD=4.5%。考察一個月內組裝有磁性復合粒子的工作電極對葡萄糖響應情況（不使用時，電極放置在4 ℃冰箱中保存）。結果表明，７天內電極響應基本不變，CV和ECL曲線形狀也基本不變；１４天后ECL強度約為原來的95%；１月后ECL強度下降85%。顯然，用本實驗方法固定GOD在Fe3O4納米粒子表面，能在微環境下保持生物蛋白的活性，從而獲得較好的穩定性。

考察了一些常見干擾物質對測定5.0×10－5 mol/L葡萄糖的影響。結果表明，10倍的尿酸和抗壞血酸對葡萄糖的檢測的影響均<5%，說明本方法選擇性好，這歸功于酶促反應特異性和ECL的高靈敏度。

３．７ 臨床血清樣品測試分析

按照實驗方法對人血清樣品（桂林理工大學附屬醫院提供）中葡萄糖的含量進行測定，結果見表1。結果表明，本方法測定結果與醫院提供的臨床分析結果相吻合。采用標準加入法測定了樣品的回收率。表1 人血清中葡萄糖的測定及回收率實驗結果（略）

從表１可見，測定結果與參考值基本吻合，回收率在95.2%～104%之間。說明本方法可用于臨床樣品的測定。