作者：劉儒平 劉軍濤 王蜜霞 羅金平 劉春秀 蔡新霞

【摘要】 采用鏈霉親和素包被磁納米粒子，將生物素標(biāo)記的特異性抗體偶聯(lián)在磁納米粒子上，制備出高特異性的磁納米探針；利用此探針對(duì)人絨毛膜促性腺激素（HCG）進(jìn)行測定，建立了定量檢測蛋白類激素的化學(xué)發(fā)光分析方法。利用紫外可見分光光度計(jì)、透射電鏡及動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)磁納米探針進(jìn)行表征，同時(shí)對(duì)化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。在2×10－4 mol/L魯米諾、8×10－4 mol/L H2O2， pH=13的優(yōu)化條件下，將磁納米探針用于HCG的定量檢測。結(jié)果表明，所測發(fā)光強(qiáng)度與待測HCG濃度之間線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.9924，線性檢測范圍由常規(guī)板式ELISA的5～200 μg/L擴(kuò)展到0.5～250 μg/L; 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.82%。采用本方法和常規(guī)ELISA法同時(shí)對(duì)34份人血清標(biāo)本HCG進(jìn)行測試，兩者相關(guān)性良好。利用制備的磁納米探針定量測定微量蛋白類激素，具有靈敏、高效、快捷、檢測范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，有望應(yīng)用于其它微量蛋白的檢測。

【關(guān)鍵詞】 化學(xué)發(fā)光免疫分析法， 磁納米探針， 動(dòng)態(tài)光散射， 人絨毛膜促性腺激素

1 引言 磁納米探針技術(shù)是以免疫學(xué)為基礎(chǔ)，利用包被有免疫活性物質(zhì)的各種磁納米粒子進(jìn)行免疫學(xué)或生物學(xué)分析的一項(xiàng)技術(shù)[1，2]。在磁納米粒子的表面引接具有生物活性的專一性抗體，可制備得到免疫磁納米探針[3]。該探針因具有比表面積大、可快速移動(dòng)及單分散性良好等優(yōu)良性能，可在磁場下定位、富集和分離[4]。化學(xué)發(fā)光免疫分析法在對(duì)免疫物質(zhì)的定性、定量和生物細(xì)胞活性功能檢測方面應(yīng)用較為廣泛，常用于超痕量活性物質(zhì)的測定。該方法具有靈敏度高、檢測范圍寬，可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化等的優(yōu)點(diǎn)。用化學(xué)發(fā)光免疫標(biāo)記物代替放射性同位素，避免了使用放射性同位素的危害，操作方法簡便快速[5]。 人絨毛膜促性腺激素（Human chorionicgonadotropin，HCG）是一種蛋白類激素，絨毛膜癌、葡萄胎等疾病的治療均需對(duì)HCG進(jìn)行定量測定[6]。目前，用于定量檢測HCG的方法有放射免疫法和酶聯(lián)免疫法。放射免疫法具有敏感度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，但卻存在放射性污染的缺點(diǎn)；酶聯(lián)免疫法不存在放射性污染問題，但靈敏度相對(duì)較低， 定量測定范圍較窄[7]。本研究采用磁納米探針檢測微量蛋白類激素，綜合了化學(xué)發(fā)光法靈敏度高、線性范圍廣、測定速度快，以及酶聯(lián)免疫法的特異性高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)利用磁性微粒在磁場中可控運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)，將待測物快速富集，具有更快的檢測速度[8]。此種磁納米探針初步應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測，取得了良好的效果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑 F4500熒光光譜儀（日本日立公司）； 123.20D DynaMagSpin磁分離器（挪威Dynal公司）； SI0146 VortexGenie旋渦混合器（美國科技儀器有限公司）； 20/20n化學(xué)發(fā)光多功能光度計(jì)（美國Promega公司）； UV2250 PC紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司)； 802型動(dòng)態(tài)激光光散色儀（美國Viscotek公司）； ZHWY2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）； J2010透射電子顯微鏡（日本電子公司）; BIOTEK Elx808酶標(biāo)儀（美國BIOTEK公司）。 人絨毛膜促性腺激素(青島康原藥業(yè)有限公司)；生物素標(biāo)記的鼠抗αHCG抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的βHCG抗體（天健生物制藥有限公司）；魯米諾試劑與H2O2（北京禾尚友生物技術(shù)有限公司）；四甲基聯(lián)苯胺(TMB，萬泰生物藥業(yè)）；磁性顆粒（陜西北美基因股份有限公司）；其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 磁納米生物探針的制備 取25 μL生物素標(biāo)記的鼠抗αHCG抗體（3 g/L），加入350 μL PBS緩沖液（pH 7.4），配制成抗體溶液。采用縮合反應(yīng)將鏈霉親和素偶聯(lián)在磁納米粒子上[9～11]，將100 μL鏈霉親和素修飾的磁納米粒子工作液（5 g/L）與該鼠抗αHCG抗體溶液混勻，置于37 ℃，150 r/min 的恒溫?fù)u床中反應(yīng)30 min，利用生物素和鏈霉親和素之間的高親和力將生物素標(biāo)記的特異性抗體偶聯(lián)在磁性納米粒子上，制備成具有高特異性的磁納米探針。探針洗滌后加入500 μL封閉液（0.05% Proclin 300與10%酪蛋白的TrisHCl緩沖液），在37 ℃，180 r/min恒溫?fù)u床中振蕩30 min后磁性分離。用PBS緩沖液清洗后，加入PBS緩沖液配制成濃度為1 g/L的磁納米探針溶液，置于4 ℃避光保存，備用。

2.2.2 磁納米探針的表征 采用紫外可見分光光度計(jì)測定標(biāo)記前的鼠抗αHCG抗體溶液(Pre)、標(biāo)記后的上清液(Post)及標(biāo)記過程中清洗液（Wash）在280 nm處的吸光度，根據(jù)公式（1）計(jì)算抗體與磁納米粒子的偶聯(lián)效率（Coupling efficiency， E）。E＝ＯＤpre－ＯＤpost－∑ＯＤwashＯＤpre×１００％（１）移取適量鏈霉親和素修飾的磁納米粒子與磁納米探針于兩個(gè)試劑杯中， 分別加入PBS緩沖液稀釋，超聲處理5 min，制備成分散懸浮液，使聚集顆粒分散為原始粒子， 并使原始粒子在分散液中保持良好的分散狀態(tài)。采用動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)磁納米粒子及磁納米探針的有效粒徑及粒徑分布進(jìn)行測量。同時(shí)采用透射電子顯微鏡（TEM）觀測磁納米探針的形貌。

2.2.3 磁納米探針用于HCG濃度的測定 采用雙抗體夾心法，利用制備的磁納米探針對(duì)HCG樣品進(jìn)行定量檢測。將HCG磁納米探針、待測HCG樣品溶液、HRP標(biāo)記的鼠抗人βHCG抗體置于離心管中，使三者充分混合，然后置于37 ℃搖床反應(yīng)25 min，形成磁納米探針待測HCG抗原酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，在磁性分離區(qū)域用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌，并采用單因數(shù)法對(duì)化學(xué)發(fā)光體系的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，在上述復(fù)合物中加入化學(xué)發(fā)光底物液（魯米諾與H2O2），酶催化底物發(fā)光，用20/20n單光子計(jì)數(shù)儀檢測光強(qiáng)，通過光強(qiáng)與待測物濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系計(jì)算樣品中HCG的濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 磁納米探針的表征 采用紫外可見分光光度計(jì)在280 nm處測得標(biāo)記前的鼠抗αHCG抗體溶液吸光度ODpre(280)=1.755、標(biāo)記后的上清液吸光度ODpost(280)=0.30、 標(biāo)記過程中清洗液吸光度∑ODwash(280)=0.1752。按照公式（1）計(jì)算得抗體偶聯(lián)效率為72.9%，表明生物素標(biāo)記的αHCG抗體與鏈霉親和素修飾的磁納米粒子具有良好的偶聯(lián)特性，抗體能高效地偶聯(lián)在修飾后的磁納米粒子表面，形成磁納米探針。

圖1 磁納米探針的形貌（略）

Fig.1 TEM image of the magnetic nanoparticle probes 采用透射電子顯微鏡對(duì)磁納米探針的形貌特征進(jìn)行描述。如圖1所示，合成的磁納米探針具有良好的單分散性。 使用激光動(dòng)態(tài)光散射儀來測定磁納米探針制作前后的平均粒度及粒度分布范圍，結(jié)果分別如圖2a和圖２b所示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。 圖2 親和素包被磁納米粒子(a)和磁性納米探針（b）的粒徑分布（略）

Fig.2 Size distribution of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles(a) and magnetic nanoparticle probes(b)

由圖2a可知，在探針制作前表面修飾鏈霉親和素的磁珠粒徑為106６ nm，粒徑分散度為7.7%。其中存在粒徑為9754 nm的產(chǎn)物，是鏈霉親和素修飾的磁納米顆粒之間的團(tuán)聚體。這種團(tuán)聚體會(huì)影響良好的磁納米探針的形成，造成檢測誤差。為消除這種團(tuán)聚，通過添加適量的緩沖液（緩沖液中含有陰離子），并采用超聲分散，使制作的水相中的磁納米探針之間存在靜電排斥力和空間位阻效應(yīng)，以達(dá)到較佳的分散效果。磁納米探針的平均粒度及粒度分布范圍如圖２b所示，磁納米探針粒徑為1295 nm，粒徑分散度為8.6%，可見此探針具有較好的粒徑分散度；粒徑為3.52 nm的粒子為游離出的αHCG抗體單體，粒徑為117 nm的粒子為αHCG抗體多聚體或αHCG抗體與鏈霉親和素的聚集體。

表1 親和素包被磁納米粒子與磁納米探針的粒徑與相對(duì)顆粒數(shù)分布（略）

Table 1 Distribution of diameters and relative numbers of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles and magnetic probes 3.2 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件

3.2.1 魯米諾濃度對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響 移取50 μL辣根過氧化酶標(biāo)記的βHCG抗體（原液濃度為0.66 g/L，用PBS緩沖液按1∶10000稀釋），分別考察了4×10－5～6×10－4 mol/L的魯米諾溶液對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3a所示。當(dāng)其它條件不變時(shí)，隨著魯米諾濃度增大，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也隨之增大，當(dāng)其濃度為2×10－4 mol/L時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大；濃度繼續(xù)升高時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度開始下降。因此，為保證該體系檢測發(fā)光強(qiáng)度最高，魯米諾濃度選為2×10－4 mol/L。

圖３ 魯米諾濃度(a)， H2O2濃度(b)和pH值(c)對(duì)相對(duì)光強(qiáng)的影響（略）

Fig.３ Effect of luminol concentration(a)， H2O2 concentration(b) and pH(c) on chemiluminescence intensity

a，b. 2×10－4 mol/L H2O2; 0.1 mol/L Tris緩沖液(Buffer solution)， pH=11.83。 c. 2×10－4 mol/L魯米諾(Luminal)；8×10－4 mol/L H2O2； 1.6×10－5 g/L HRPβHCG抗體（Antibody）.

3.2.2 H2O2濃度對(duì)光強(qiáng)的影響 移取50 μL辣根過氧化酶標(biāo)記的βHCG抗體（原液濃度為0.66 g/L，用PBS緩沖液按1∶10000稀釋）， 在魯米諾濃度為2×10－4 mol/L時(shí)，考察了H2O2濃度在4×10－5～1×10－3 mol/L范圍內(nèi)對(duì)相對(duì)光強(qiáng)的影響，如圖3b所示。體系光強(qiáng)隨著H2O2濃度的增大而增強(qiáng); 當(dāng)H2O2濃度為8×10－4 mol/L時(shí)，H2O2魯米諾體系具有最大的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度; 隨著H2O2濃度的繼續(xù)增大，體系發(fā)光強(qiáng)度降低。因此，H2O2最優(yōu)濃度為8×10－4 mol/L。

3.2.3 pH值對(duì)光強(qiáng)的影響 魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行[12]，輻射出最大發(fā)射波長為425 nm 的化學(xué)發(fā)光。因此，采用0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3緩沖體系為測定工作液，在反應(yīng)中，通過改變魯米諾溶液中NaOH的濃度來改變反應(yīng)體系的pH值，以提高反應(yīng)體系的靈敏度，進(jìn)一步考察了上述最優(yōu)濃度配比的H2O2魯米諾體系在pH 8.0～14.0范圍內(nèi)變化時(shí)，pH值對(duì)H2O2魯米諾體系發(fā)光強(qiáng)度的影響。圖3c表明，若pH<8.0時(shí)沒有光信號(hào)產(chǎn)生；當(dāng)pH>8.0時(shí)，體系發(fā)光強(qiáng)度隨pH值的增大而緩慢增強(qiáng)；pH =13時(shí)體系的發(fā)光強(qiáng)度迅速增到最大；當(dāng)pH>13時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度迅速減小。因此，最優(yōu)pH值選擇pH=13。

3.3 樣品測定

3.3.1 干擾實(shí)驗(yàn) 考察與HCG有部分類似結(jié)構(gòu)的不同濃度蛋白類激素對(duì)10 μg/L HCG標(biāo)準(zhǔn)品測定的干擾情況。結(jié)果表明，40 μg/L的促甲狀腺激素(TSH)、促黃體生成素(LH)、促卵泡激素（FSH）、雌二醇(E2)對(duì)HCG的測定均無影響（RSD＜5%)，證明本磁納米探針特異性強(qiáng)。

3.3.2 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性 利用同批次制備的磁納米探針對(duì)6份濃度為10 μg/L HCG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.82%；利用不同批次制備的磁納米探針對(duì)6份濃度為10 μg/L HCG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.94%，具有良好的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性。采用4 ℃避光保存的同一批次制備的磁納米探針，每3 d對(duì)同一濃度的HCG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，24 d內(nèi)測定8次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.02%。結(jié)果表明，本探針在24 d內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性，具體有效期仍需進(jìn)一步研究。

3.3.3 HCG標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，依據(jù)檢測體系中待測物濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在一定條件下呈線性關(guān)系的原理[13]，利用制備的磁納米探針，采用化學(xué)發(fā)光檢測儀對(duì)不同濃度HCG標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定。結(jié)果表明，HCG濃度在0.5～250 μg/L范圍內(nèi)與相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系。其線性方程為y=32.953x+5390.3，相關(guān)系數(shù)r=0.9924。

圖４ 磁納米探針分析法與ELISA法相關(guān)性分析散點(diǎn)圖（略）

Fig.４ Scatterplot of correlation analysis between magnetic nanoparticle probe and ELISA

本探針的檢測待測樣品時(shí)間少于40 min，具有檢測速度快、特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)。

3.3.4 實(shí)際樣品測定 采用同批次制備的磁納米探針檢測了34例臨床血清標(biāo)本（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院健康體檢人群血清標(biāo)本），同時(shí)采用常規(guī)ELISA方法進(jìn)行平行檢測。常規(guī)ELISA方法檢測HCG時(shí)，首先繪制不同濃度的HCG與ELISA吸光度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將所測樣品的OD值換算為濃度。兩者結(jié)果經(jīng)線性相關(guān)分析后得散點(diǎn)圖（圖４），結(jié)果顯示，將特異性磁納米探針用于檢測蛋白類激素與常規(guī)ELISA法具有良好的相關(guān)性，線性相關(guān)方程為y=0.9979x+2.4625， 相關(guān)系數(shù)r=0.9743。 本研究建立了一種寬范圍定量檢測蛋白類激素的方法。本方法操作簡單，快速，靈敏度高，無放射性污染，具有應(yīng)用于檢測蛋白質(zhì)類和多肽類抗原的應(yīng)用前景。