作者：劉玫瑰 曹春 曹明 朱昌青

【摘要】 參照文獻方法合成了BSA保護的水溶性發(fā)光金納米粒子， 并考察了此探針在非離子表面活性劑曲通X100中的發(fā)光行為。根據(jù)觀察到的發(fā)光增強效應(yīng)， 建立了一種簡單的測定曲通X100的方法。考察了發(fā)光金納米粒子的濃度、體系酸度、反應(yīng)時間及共存物質(zhì)對測定的影響。在最佳條件下， 發(fā)光強度與曲通X100的濃度分別在0～150 μmol/L和150～600 μmol/L范圍內(nèi)分段成正比關(guān)系。兩條工作曲線的交點所對應(yīng)的濃度與曲通X100的臨界膠束濃度十分吻合， 為膠束形成過程提供了直接的指示。作為一種生物相容性探針， 發(fā)光金納米粒子被用于生物學(xué)樣品中曲通X100的分析測定， 結(jié)果令人滿意。

【關(guān)鍵詞】 曲通X100， 臨界膠束濃度， 發(fā)光金納米粒子

1 引 言

曲通X100(TX100)是一種重要的非離子表面活性劑， 廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域[1，2]。如在免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)中， TX100可通過溶解細胞膜上的脂質(zhì)成分， 使抗體進入細胞[3]。檢測TX100的濃度， 對理解它與一些物質(zhì)的相互作用具有重要意義。Singh等[4]使用微分掃描熱分析、熒光和圓二色譜法研究了TX100與球蛋白的相互作用， 發(fā)現(xiàn)兩者之間可通過直接的鍵合作用結(jié)合， 且兩者結(jié)合的化學(xué)計量比隨TX100濃度不同而變化。魏曉芳等[5]研究了TX100與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用， 發(fā)現(xiàn)二者會形成復(fù)合物， 由此導(dǎo)致BSA熒光猝滅。 在不同TX100 濃度下， 二者的結(jié)合常數(shù)和絡(luò)合比均不同。TX100在溶劑中締合形成膠束時所需的最低濃度即臨界膠束濃度(CMC)， 是一個重要的物理參量。常用的測量方法有電導(dǎo)法、表面張力法、折射率法及光散射法等[6]。熒光方法具有操作簡單， 分析速度快的特點， 也常用于表面活性劑及其CMC值的測定。 迄今所用的探針大多為有機熒光染料[7，8]。

與有機熒光染料相比， 發(fā)光金納米粒子(Luminescent gold nanoparticles， GNPs)具有獨特的發(fā)光性能和良好的生物相容性等優(yōu)點。近年來， 利用各種方法[9～11]合成出的GNPs已用于溶液中Hg2+ [11]和Ni2+ [12]的測定， 以及細胞成像[10]分析。

本實驗參照文獻[13]的方法合成了牛血清白蛋白(BSA)修飾的GNPs。實驗發(fā)現(xiàn)， 水中的溶解氧對GNPs的發(fā)光有明顯的猝滅效應(yīng)，而在體系中加入TX100， 則能有效降低溶氧對GNPs猝滅。在最佳條件下， 發(fā)光強度與TX100的濃度分別在0～150 μmol/L和150～600 μmol/L范圍內(nèi)分段成正比關(guān)系， 可據(jù)此建立靈敏的測定TX100的發(fā)光方法。此外， 兩條工作曲線的交點所對應(yīng)的濃度與TX100的CMC值十分吻合， 為測定其CMC值、判斷膠束的形成提供了簡單的方法。利用此生物相容性探針， 測定了實際生物學(xué)樣品中TX100的含量， 結(jié)果令人滿意。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

F4500熒光分光光度計(日本Hitachi公司); U3010紫外可見分光光度計(日本Hitachi公司); JEOL2010高分辨電鏡(HRTEM， 日本電子株式會社); 851型磁力攪拌器(江蘇金壇正基儀器有限公司); TGL16C型高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin， BSA); 曲通X100(Triton X100， TX100， 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司; 所用試劑均為分析純; 水為二次蒸餾水。

2.2 實驗方法

2.2.1 GNPs的制備[13] 0.125 mL 1% HAuCl4·4H2O(m/V)稀釋到20 mL，加入134 mg BSA ， 劇烈攪拌2 h， 加入30.6 mg NaBH4繼續(xù)反應(yīng)24 h， 高速離心除去較大粒徑的粒子后備用。HAuCl4·4H2O與BSA的摩爾比是3∶1。以L色氨酸的量子效率(QY)為基準(QY=0.14)， GNPs的量子效率QY=0.052 ， 與文獻[13]一致。

2.2.2 樣品處理 在一系列10 mL具塞試管中分別加入0.48 mL GNPs溶液、1 mL 0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3(pH 9.9)緩沖溶液， 然后加入不同量的TX100標準溶液或樣品溶液， 稀釋至6.0 mL并充分搖勻， 在室溫下放置10 min后進行熒光測定。

熒光測量在室溫(15 ℃)下進行， 采用光通路10 mm的石英比色皿， 激發(fā)波長為320 nm， 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10 nm; 光電倍增管的電壓為-700 V。

實際樣品由安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。取校園植物(卷柏、雪松)， 剪碎， 放研缽中加液氮磨碎。稱取該新鮮植物細胞樣品0.1 g， 用0.001 mol/L TX100溶液在65 ℃水浴中振蕩處理50 min， 離心后取不同量的上層清液按分析步驟進行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 發(fā)光金納米粒子的表征及其與TX100的相互作用

圖1是GNPs的透射電鏡圖。 由圖1可以看出， 所制備的GNPs的尺寸約為5.3 nm， 尺寸較均一。如圖2所示， 隨著TX100濃度增加， GNPs的熒光發(fā)射逐漸增強， 且發(fā)射峰位自412.4 nm， 紅移至423.3 nm。此現(xiàn)象的原因可能同于膠束對有機染料的增敏作用。在膠束形成之前， 以單體形式存在的TX100與GNPs作用[4]， 不斷改善了GNPs所處的微觀環(huán)境， 穩(wěn)定其發(fā)光， 使熒光增強。當TX100膠束形成后， 在GNPs表面形成保護層， 有效地減小了分子間碰撞機率和氧的猝滅常數(shù)， 屏蔽了GNPs的激發(fā)態(tài)， 有利于熒光與非輻射去活化過程及各種猝滅過程的競爭[14]， 使體系位能下降和粒子激發(fā)態(tài)的電子能級下移， 導(dǎo)致熒光峰紅移[13～15]。對照實驗發(fā)現(xiàn)， 水中的溶解氧能猝滅GNPs的熒光。 當通入氮氣后，熒光強度明顯回升， 可見膠束能有效地避免溶氧對GNPs的發(fā)光猝滅。

.3.2 實驗條件優(yōu)化

3.2.1 發(fā)光金納米粒子濃度選擇 隨著GNPs濃度的增加， 熒光增強程度逐漸增加。 但是當粒子濃度達到8.0 μmol/L(以BSA濃度計算)[13]時， 可能是由于GNPs間的自猝滅效應(yīng)， 發(fā)光增強程度開始降低。為獲得高的分析靈敏度， 選擇了8.0 μmol/L GNPs用于進一步的實驗。

3.2.2 酸度與介質(zhì)的影響 用10 μmol/L TX100考察了其pH 4.0～10.8的GNPs的發(fā)光增強作用(圖3)。由圖3可見， pH在3～12變化時， GNPs本身的發(fā)光強度有很大不同， 這與文獻[13]一致， 但熒光增強程度基本保持不變， 說明酸度對測定的靈敏度影響不大。實驗選擇了pH 9.9的Na2CO3NaHCO3緩沖溶液。 圖3 不同pH時GNPs在TX100存在(F)和不存在(F0)條件下的發(fā)光強度

3.2.3 反應(yīng)時間的影響 試劑混合10 min后， 體系的發(fā)光強度即趨于穩(wěn)定， 因此，選擇10 min后測定發(fā)光強度。

3.3 干擾實驗

考察了幾類可能共存的物質(zhì)對10 μmol/L TX100測定的影響。陽離子表面活性劑十二烷基三甲基溴化銨、十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基三甲基溴化銨、氯代十六烷基吡啶;陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉和部分生化物質(zhì)血紅蛋白尿、細胞色素C、小牛胸腺DNA、葡萄糖等在至少高于10倍測定量時對測定無干擾。高于20倍測定量的SO2-4，CO2-3，Ca2+， Mg2+， Bi3+，Mn2+，Zn2+對TX100的測定也不產(chǎn)生明顯干擾， 但是Ni2+，Cu2+ ，Hg2+ ，Ag+能猝滅GNPs的發(fā)光。它們的存在， 尤其是在濃度較高時， 會對TX100的測定產(chǎn)生干擾。因此， 在某些樣品的實際測定中， 采取適當?shù)拇胧?如巰基棉處理[16]來消除這些共存重金屬離子的干擾。

3.4 工作曲線

如圖4所示， 在最佳條件下， GNPs的熒光強度與TX100的濃度在0～150 μmol/L和150～600 μmol/L范圍內(nèi)分段呈線性關(guān)系。據(jù)此可建立測定TX100的簡單方法。本方法具有較寬的濃度范圍， 分析的靈敏度略高于文獻[17]方法。在最佳條件下， 對20 μmol/L TX100進行6次平行測定， 標準偏差為 2.8%。 圖4 在320 nm激發(fā)光激發(fā)下， GNPs的發(fā)射強度與TX100溶液濃度的關(guān)系

Fig.4 Relations of Triton X100 concentrations with the emission intensity of GNPs excited at 320 nm

從圖4可見， 兩條工作曲線(5次測定的標準偏差分別是3.3%和3.1%)的交點對應(yīng)的TX100的濃度為0.18 mmol/L， 與文獻[18]報道值(170～300 μmol/L)十分吻合， 表明GNPs是測定TX100 CMC的一種理想的探針。

3.5 實際樣品的測定

利用GNPs這種生物相容性探針， 對經(jīng)TX100處理后的卷柏和雪松細胞樣品中TX100含量進行了測定(表1)， 加標回收率為96%～105%， 表明本方法可用于某些生物學(xué)樣品中TX100的實際分析。表1 實際樣品中TX100的含量測定