作者：干寧 王魯雁 李天華 鄭 磊 王 峰

【摘要】 在玻碳電極(GCE)表面固定對H2O2有催化還原活性的富馬酸二甲酯聯(lián)吡啶銅(GCE|CuL);再在GCE|CuL表面修飾一層金磁微粒殼聚糖復合膜(nano Au/Fe3O4/Chit)， 進而固定艾滋病毒(HIV)診斷標志物——包膜糖蛋白(gp160)抗體(anti gp160)， 由此構(gòu)建了一類快速檢測 gp160的無試劑安培免疫傳感器。當該傳感器在含gp160溶液中37 ℃下溫育30 min后， 傳感器表面生成的免疫復合物隨gp160濃度的增大而增加， 導致CuL 對H2O2 電催化還原效果降低， 催化電流呈現(xiàn)下降趨勢。在PBS溶液(pH 7.0)和-300 mV下， 催化電流的降低值ΔIo與gp160濃度在1～400 μg/L 呈線性關(guān)系; 檢出限為0.5 μg/L(3σ)。研制的免疫傳感器檢測gp160時， 一步免疫反應即可得結(jié)果， 較相同條件下包被gp160抗體的納米金單分子層修飾電極靈敏度更高， 檢測范圍更寬， 有望用于艾滋病人血清標志物gp160快速篩測。

【關(guān)鍵詞】 富馬酸二甲酯聯(lián)吡啶銅， 納米金， 磁性微粒， 殼聚糖， 艾滋病毒，包膜糖蛋白， 安培免疫傳感器

1 引 言

人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的早期檢出對杜絕艾滋病傳播極其重要， 常用的艾滋病診斷方式是抗體檢測[1]。在艾滋病毒感染早期， 人體內(nèi)尚未出現(xiàn)抗體(即 “窗口期”)， 已具有很強的傳染性[2]。此時，“窗口期”HIV的診斷標志物——包膜糖蛋白抗原(gp160)已經(jīng)存在于人血清中， 但含量很低(<8 μg/L)， 若能對其檢測將有效縮短診斷“窗口期”[3]。目前， 主要采用化學發(fā)光酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測痕量gp160[3]， 該法雖然結(jié)果準確， 但是操作繁瑣、儀器昂貴， 限制了其推廣。電化學免疫分析具有操作簡便、樣品量少、快速靈敏等特點， 已應用于臨床檢測[4～9]。由于缺乏簡單而又能長期保持抗體生物活性的電極固定方法， 且通常需要在反應體系中加入電子媒介體(eT)以加速電子傳遞， 導致基底干擾并使抗體失活， 限制了其應用[5～9]。近年來， 通過在金膠等具有良好生物兼容性的納米顆粒上包被抗體， 并將其與eT共固定到電極表面， 獲得了靈敏度高、無需外加eT、且抗體不易失活的無試劑安培免疫傳感器[10～14]。He等[9]通過在電極表面的殼聚糖(Chit)膜上層層電沉積納米金， 包被癌胚抗原(CEA)抗體， 獲得了測定CEA的安培免疫傳感器。由于電極表面有多層納米金， 比單分子層納米金吸附更多抗體， 因此在檢測CEA時線性范圍更寬， 靈敏度更高。然而該電極檢測需在電解池中加鐵氰化鉀作eT， 體系復雜，易導致抗體失活， 且電極表面需多步納米修飾， 操作繁瑣。本研究組在單分散Fe3O4微粒表面負載納米金， 合成了nano Au/Fe3O4金磁性微粒[12]。在每個Fe3O4微粒表面包裹著多個納米金， 再接枝到電極表面形成單分子層將比單層納米金吸附更多抗體， 擴展傳感器檢測范圍， 提高靈敏度。某些銅配合物具有催化H2O2活性， 可代替H2O2酶被修飾在電極表面制作H2O2傳感器[15]?；谝陨纤悸罚?本實驗合成了對H2O2具有催化活性的富馬酸二甲酯聯(lián)吡啶銅(CuL)[16]， 將其與gp160抗體包被金磁微粒殼聚糖復合膜共固定在GCE上， 制備了gp160免疫傳感電極， 并用于血清樣本檢驗。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

CHI660B電化學分析工作站(上海辰華公司);三電極體系：GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(φ=2 mm)為工作電極， 鉑電極為對電極， 飽和甘汞電極為參比電極;Easysizer20激光粒度儀(美國歐美克公司);VF320型X射線熒光光譜儀(日本島津公司);PHI5400X射線光電子能譜儀(美國PE公司)， Hitachi X650掃描電鏡(日本Hitachi公司)。

直徑50～400 nm的Fe3O4微粒(美國Fluka公司);3巰丙基三乙氧基硅烷(95%)、殼聚糖(Chit， 脫乙酰度>90.0%)及AuCl3·HCl·4H2O購自上海國藥試劑公司。人抗人類免疫缺陷病毒抗體(HIV)ELISA試劑盒(美國ADL公司)：包括不同濃度(0～500 μg/L)的gp160抗原和單克隆gp160抗體(Anti gp160);牛血清蛋白(BSA， 96%～99%)與人血清蛋白(HSA， 96%～99%)購自美國Sigma公司。其它試劑均為分析純， 實驗用水為超純水(美國Millipore純水器)。

2.2 Nano Au/Fe3O4/Chit共聚物合成

按文獻[16]合成富馬酸二甲酯聯(lián)吡啶銅([Cu(bpy)2(H2O)]2(C6H8O4)2(ClO4)4)。Nano Au/Fe3O4溶膠

2.3 GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160 電極的制備和檢測

將玻碳電極浸于1.0 mmol/L CuL二甲苯溶液中，10 h后取出， 以二次蒸餾水反復沖洗去除電極表面雜質(zhì)， 自然干燥， 制得 GCE|CuL 電極[15]。按照文獻[9]方法， 取10 μL nano Au/Fe3O4/Chit溶液滴在GCE|CuL電極表面形成一層穩(wěn)定膜， 室溫晾干， 進而將其浸入anti gp160溶液中于25 ℃放置7 h， 即得GCE|CuL/nanoAu/Fe3O4/Chit/anti gp160免疫電極。再將此電極浸入5%BSA溶液中5 h， 封閉抗體未包被的電極表面， 制備過程見圖1。實驗中始終維持N2氣氛。

2.4 測定過程

本免疫分析是基于免疫結(jié)合物的生成阻礙CuL與H2O2之間的電子傳遞而進行測定。參照文獻[14]方法， 首先分別測定在5 mL 除氧的0.1 mol/L PBS 溶液(pH 7.0)和含1 mmol/L H2O2 的相同底液中， 免疫傳感器在-300 mV 下電解120 s時的安培響應i0和iH。將免疫傳感器在含待測gp160的溶液中于37 ℃下溫育30 min， 在同樣條件下測定含1 mmol/L H2O2的PBS 溶液(pH 7.0)中的安培響應i， 計算安培響應的降低百分率100×(iH-i)/(iH-i0)。

3 結(jié)果與討論

3.1 HIV免疫傳感器的表征

采用交流阻抗譜對電極修飾過程進行了表征。如圖2所示， 裸GCE上FeCN高頻區(qū)的Ret較小。隨著CuL， Chit， nano Au/Fe3O4/Chit膜不斷修飾到GCE后(圖2 b～d)， 高頻區(qū)半圓直徑不斷增大， 表明抗體修飾膜的形成阻礙了FeCN電化學反應。 圖2 免疫傳感器制備過程中不同電極的交流阻抗圖

Fig.2 AC impedance plot of(a) bare GCE(b) GCE|CuL(c) GCE|CuL/Chit(d) GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(e) the electrode of(d) closed by BSA in 5 mmol/L Fe(CN)3-/4-6+0.5 mol/L KCl solution. The frequency range was 0.1-1.0×105 Hz

采用SEM對包被抗體前后的電極表面進行了表征。圖3a顯示電極表面有許多白色亮點， 推測是nano Au/Fe3O4反射形成的[14];當 anti gp160 包被后， 電極表面形態(tài)發(fā)生了明顯變化， 出現(xiàn)了很多島型片狀物質(zhì)， 推測是抗體固定在電極表面的形貌(圖3b)。

圖3 (a) GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit和已經(jīng)包被anti gp160電極(b)的掃描電鏡圖

Fig.3 Scan electron microscopic images of GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit(a) and GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160 electrode(b)采用X射線熒光光譜(測定元素范圍為9F～92U)對免疫傳感電極表面進行表征， 顯示了Cuk(峰(2θ=123.7)和Sk(峰(2θ=110.5)， 由于gp160抗體富含甲硫氨基酸[3]， 說明CuL和anti gp160被修飾到電極表面。對吸附了CuL的石墨片進行了XPS分析， 932.7/954.3 eV處出現(xiàn)了Cu2+的特征峰Cu(2P3/2， 2P1/2)， 表明銅離子為+2價。

3.2 GCE|CuL和GCE|CuL/nano Au/Fe3O4修飾電極的伏安行為

GCE|CuL修飾電極在PBS(pH 7.0)中的循環(huán)伏安曲線如圖4A所示。由圖4A(a)可知， 在掃描速度100 mV/s時， CuL有一對穩(wěn)定的氧化還原峰， 峰電位分別為14和-310 mV。在底液中加入1 mmol/L H2O2后， 還原峰增大而氧化峰減小(圖4A(b))， 說明GCE|CuL可催化H2O2的還原。在GCE|CuL上修飾Fe3O4微粒后， 電極在PBS中的氧化還原電流顯著提高(圖4A(c))， 而GCE|CuL修飾nano Au/Fe3O4后電流增強更明顯(圖4A(d))。

文獻[17， 18]報道納米Fe3O4和納米Au均有增強GCE表面電子傳遞功能， 并可提供抗體維持活性的微環(huán)境。本實驗發(fā)現(xiàn)兩者形成復合微粒后， 這種增強效應具有可疊加性。GCE|CuL在50～300 mV/s掃速范圍內(nèi)， 陽極和陰極峰電流均隨掃速增大而增加， 并呈線性關(guān)系(圖4B)， 表現(xiàn)出明顯的表面控制過程。由不同掃速下陰極與陽極峰的電位差可計算獲得該過程的平均電子傳遞速率為(1.57±0.12) s-1。CuL表面覆蓋度為(9.02±1.13)×10-10 mol/cm2， 這一數(shù)值相當于電極表面覆蓋的為單分子層[13]。計算得反應電子數(shù)n=1.77≈2， 表明電極表面發(fā)生了Cu/Cu(0)的電子轉(zhuǎn)移。

圖4 (A) GCE|CuL電極在0.02 mol/L PBS(pH 7.0)底液中(a)和加入1 mmol/L H2O2后(b);GCE|CuL/Fe3O4電極(c)和GCE|CuL/nano Au/Fe3O4 電極(d)在相同底液中的循環(huán)伏安圖; (B) GCE|CuL電極在不同掃速下的的循環(huán)伏安圖

Fig.4 (A) Cyclic voltammogram of GCE|CuL CME not add(a) and added 1 mmol/L H2O2(b); GCE|CuL/Fe3O4(c) and GCE|CuL/nano Au/Fe3O4 CME(d) in 0.02 mol/L PBS(pH 7.0) at scan rate of 100 mV/s. (B) Cyclic voltammogram of GCE|CuL CME at different scan rate， a～f: 50， 100， 150， 200， 250 and 300 mV/s， respectively. 插圖(Insert): ip～v3.3 免疫傳感器的電化學行為及對gp160檢測

圖5a為裸電極在底液中循環(huán)伏安(CV)圖， 沒有任何電流響應。圖5b為該免疫傳感器在底液中CV圖， 和相同掃速下的GCE|CuL相比(圖4a)， 氧化峰電位正移而還原峰電位負移。由實驗可知nano Au/Fe3O4， Chit， anti gp160均無電活性， 故氧化還原峰對應于CuL的氧化還原反應可逆性下降， 可歸因為Chit和anti gp160均不導電且分子較大， 阻抗增加， 顯著阻礙了CuL的電子傳遞效率。當在底液中加入1 mmol/L H2O2后， 還原峰增大， 氧化峰減小， 峰電位不變(圖5c)， 將電極在0.2% HSA中溫育后， 電流無明顯變化(圖5d)， 表明其對非特異性蛋白吸附很小;而將電極在50 μg/L gp160 溶液中溫育30 min后， 電流明顯減小(圖5e)， 電流減少值Δi0和gp160的加入量呈正比。將該傳感器放入pH 4.0～ 8.0的PBS緩沖液中進行循環(huán)掃描， 電極的氧化還原峰電勢隨pH值的增加線性負移， 圖5 免疫傳感器測定gp160的循環(huán)伏安圖

Fig.5 Cyclic voltammograms of bare GCE(a)， immunosensor(b)， immunosensor(c)， immunosensor after incubated with 0.2% HSA(d)， and immunosensor after incubated with 50μg/L gp160(e) at 100 mV/s in pH 7.0 PBS containing 1 mmol/L H2O2ΔEpa/ΔpH=-52 mV/pH; ΔEpc/ΔpH=-54 mV/pH。由于CuL在電極反應中的電子得失數(shù)為2， 推測每個配位的富馬酸含有2個COO-可得失H+。推斷檢測機理如圖6：CuL在電極上被還原為Cu(0)L， 溶液中的H2O2通過擴散達到電極溶液界面， 將Cu(0)L氧化成CuL， 而自身被還原成H2O。當gp160和anti gp160發(fā)生免疫結(jié)合后， 免疫生成物阻礙H2O2到達電極表面的傳質(zhì)過程， 電極催化H2O2電流下降。

3.4 實驗條件的優(yōu)化

優(yōu)化了CuL和抗體在GCE電極表面的修飾條件。GCE在1 mmol/L CuL中浸泡后， 電流在0～10 h內(nèi)不斷增加， 10 h后不再增加， 說明此時CuL在電極表面吸附基本飽和。將得到的GCE|CuL表面固定nano Au/Fe3O4/Chit膜， 并于25 ℃在100 μg/L gp160抗體(試劑盒中貯備液濃度)溶液中浸泡， 0～7 h內(nèi)電流不斷下降， 7 h 后基本穩(wěn)定， 說明抗體在金膠上吸附飽和。因此CuL和gp160抗體的浸泡時間分別選擇10和7 h。

圖6 免疫傳感器對gp160檢測原理示意圖

Fig.6 Procedure of immunosensor for gp160 detection免疫反應受pH、H2O2、濃度、溫育時間等影響。考察了免疫傳感器在不同pH底液中對1.0 mmol/L H2O2的催化響應。研究發(fā)現(xiàn)， 峰電流在pH 3.5～7.0逐漸增大;pH>7.0后， 峰電流開始減小。因此，最佳pH值選擇7.0。本傳感器對H2O2響應迅速， 電流達到穩(wěn)態(tài)僅需2 s， 明顯快于納米金修飾電極[10]。H2O2濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)與電流響應呈良好線性關(guān)系;濃度再提高， 電流響應改變不大。所以， 本實驗采用1.0 mmol/L H2O2。隨著溫育時間的延長， 催化電流的下降值Δi0隨之增加， 當達到30 min后趨于穩(wěn)定值， 說明此時電極表面免疫反應已經(jīng)進行完全。這比一般的酶聯(lián)免疫溫育時間(50～60 min)縮短了2倍[13]， 這是因為本方法基于一次性免疫分析， 較夾心ELISA法減少了二抗的加入?？疾炝穗娢粚2O2安培測定的影響， 當電位在-150 mV附近時， 就可以觀察到H2O2在電極表面的還原， 電位負移到-400 mV， 電流大幅度增大。這是因為電位越負， 對H2O2還原驅(qū)動力就越大。當電位為-300 mV時， 安培響應達到一個平臺。所以本傳感器的最佳反應條件為： 在pH 7.0的PBS底液中， 1.0 mmol/L H2O2， 在37 ℃(試劑盒標示反應溫度)下溫育30 min， 電解電位為-300 mV。

3.5 Fe3O4磁性粒子尺寸與磁性對金膠及抗體的吸附影響

考察了粒徑為50， 100， 200， 300和400 nm的Fe3O4微粒在相同條件下吸附納米Au的情況。TEM研究發(fā)現(xiàn)， Fe3O4微粒粒徑越大， 負載的納米Au越多， 且吸附的抗體也越多;但是如果金磁微粒粒徑過大， 電極表面Chit膜固定后， 循環(huán)伏安掃描50～100次后容易脫附， 造成電流響應急劇下降。比較發(fā)現(xiàn)Fe3O4微粒粒徑為200 nm時合成的金磁微粒在電極表面掃描后不容易脫附， 且可負載10～20個直徑約為30 nm納米Au。Crumbliss等[18]研究發(fā)現(xiàn)， 小尺寸的金膠(～30 nm)能給予蛋白質(zhì)更多的取向自由度， 從而增加輔基靠近金膠的機會， 使電子方便地通過金膠的傳輸通道。而本實驗合成的單分散nano Au/Fe3O4上金膠直徑約為30 nm， 故具有較好的抗體包被和電子傳輸能力。由于Fe3O4具有超順磁作用， 彼此容易發(fā)生團聚而使得電極上的納米界面喪失， 且隨著尺寸變小團聚速度加快[17]， 本實驗中， 50～100 nm金磁微粒在Chit膜中30 min內(nèi)會發(fā)生團聚， 引起電流響應變小;而對于粒徑>200 nm的金磁微粒，團聚效果較小， 在Chit中分散7 d后也很少團聚， 且制備的傳感器電流大小不變。因此選用200 nm粒徑的單分散Fe3O4微粒負載納米金并包被抗體。

3.6 多種免疫傳感器對HIVgp160的安培測定比較

在優(yōu)化條件下， 傳感器溫育后安培響應的降低百分率與gp160濃度呈良好的線性關(guān)系， 線性范圍為1～400 μg/L， r=0.9960， 檢出限為0.5 μg/L(3σ)， 與化學發(fā)光ELISA法相當(0.2 μg/L， 0.5～350 μg/L)[3]， 明顯優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附比色法(2 μg/L， 5～150 μg/L)[2]。但是本法較上述方法簡便快速、價廉。分別比較了本電極(GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160)和抗體包被的納米金修飾電極(GCE|CuL/nano Au/Chit/anti gp160)， 以及抗體包被chit膜電極(GCE|CuL/Chit/anti gp160)對不同濃度gp160的檢測效果。結(jié)果表明， 在相同制備條件下， 本電極對gp160檢測靈敏度(2.5 A·L/g·cm2)最高， 金納米修飾電極和chit膜電極分別為0.7和0.2 A·L/g·cm2)， 測定范圍也較后二者(1～250 μg/L和2～100 μg/L)寬近1～2倍。這是因為每個金磁微粒上有多個納米金， 其在電極表面形成單分子層時比納米Au有更多的gp160抗體固定點， 所以本研究傳感器靈敏度更高， 檢測范圍更寬。

將本電極在4 ℃儲存于pH 7.0的PBS 溶液中45 d 后， 其對50 μg/L gp160安培響應降低6.5%， 說明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

3.7 干擾實驗、耐用性和電極表面再生

以50 μg/L gp160為比對標準， 依次加入8.8 mmol/L 葡萄糖， 0.24 mmol/L 尿酸， 0.5 mmol/L 抗壞血酸(人血清中主要組分的正常濃度水平)， 研究表明響應電流變化很小(<10%)， 證明該傳感器具有良好的抗干擾性。采用同一電極測定50 μg/L gp160 30次后電流下降值<7%。繼續(xù)測定會使少量血清蛋白吸附在電極表面， 導致電流減小， 但隨后將電極在含有0.1 mol/L的鹽酸胍PBS底液中浸泡12 h， 抗原從抗體上脫附， 其電流即可恢復到未使用前狀態(tài)。因此可用鹽酸胍PBS浸泡使電極表面再生。

3.8 加標回收實驗

在正常人血清中加入了6～10 μg/L gp160標準品， 取1 mL樣本溶解在5 mL電解質(zhì)中， 采用本方法進行測定，并與標準EILSA法對比， 結(jié)果見表1， 吻合性較好。本方法的加標回收率為95%～102%， 表明本傳感器適用于血清中HIV gp160含量的測定。表1 血清樣品中HIV gp160檢測結(jié)果(n=7)