【摘要】 碳納米管具有獨特的結構及性質，被廣泛應用于生物醫學領域。本文對碳納米管在生物醫學特別是腫瘤早期診斷以及治療方面的研究現狀進行了綜述，分析了現有的研究特點，并展望了該領域的發展趨勢。

【關鍵詞】 碳納米管， 碳納米角， 生物醫學， 腫瘤， 診斷， 治療，評述

1 引 言

碳納米管(CNTs)自1991年被發現以來[1]，以其獨特的結構以及優異的熱學、電學和力學性質如較大的比表面積、良好的傳熱性、導電性及較高的機械強度引起廣泛關注，成為納米材料領域的研究熱點。大量的研究工作表明，碳納米管在電子器件、復合材料、儲氫材料、催化劑載體、分子吸附劑、化學和生物傳感器等方面均具有巨大的應用潛力。近年來，碳納米管應用在生物醫學特別是在藥物載體上的研究逐漸成為新熱點[2～6]，隨著腫瘤發病率的逐年上升，雖然治療手段有所進步，生存率有所提高，但死亡率仍然居高不下，而傳統的診斷及治療手段仍然存在不少缺點。因此，需要更為有效安全的手段以實現腫瘤的早期診斷以及治療[7～10]。本文綜述了碳納米管在生物醫學領域特別是腫瘤早期診斷和治療的研究現狀，分析了現有的研究特點，并展望了這一研究領域的發展趨勢。

2 腫瘤細胞診斷

2.1 磁共振成像

磁共振成像(MRI)技術中造影劑(CAs)的應用越來越廣泛，以其磁性的不同可分為3大類：順磁性、超順磁性和鐵磁性物質，而基于碳納米材料的磁共振成像造影劑研究主要集中在前兩類。

2.1.1 順磁性 順磁性造影劑以釓的螯合物為主，由于具有未成對電子使Gd3+具有順磁性，從而縮短周圍水中質子的縱向弛豫時間。Hashimoto等[11]報道了一種把Gd3+選擇性地沉積在碳納米角親水性孔洞的新方法(圖1a)。碳納米角(CNHs)是一種特殊的單壁碳納米管(SWNTs)，具有圓錐型的帽狀末端并以放射型聚集狀態存在。由于帽狀末端以及管壁存在著缺陷，可以通過氧化作用破壞碳管造成空洞從而使Gd3+以氧化物形式聚集在碳納米角的中央[11]。Sitharaman等[12]進行了相似的研究，把CdCl3沉積到超短的SWNTs內部(圖1b)，其弛豫度為商用造影劑的40～90倍，其成像性能的極大提高

圖1 GdoxNH的透射電鏡圖(a)[11]和Gd3+n@UStubes的高分辨透射電鏡圖(b)[12]

Fig.1 (a)TEM image of gadolinium oxidized nonohorns(GdoxNH)[11]and (b) high resolution TEM image of the Gd3+@ultrashot nanotubes [12]推測為碳管對管內金屬離子簇合物的限制作用而引起。后續的研究[13]證明，該復合物在pH 7.0～7.4范圍內其弛豫度對酸堿度極其敏感。由于癌組織與正常組織之間pH值存在差異，因此，有望應用于腫瘤的早期診斷。Richard等[14]則把兩性的金屬釓螯合物吸附在多壁碳納米管(MWNTs)上。該復合物不僅具有陽性造影劑的順磁性，在動物實驗的T2權重圖像中還造成信號的負增強，推測為碳管管壁電子的運動造成磁矩而使碳管本身帶磁感而引起。由于碳納米管的長度較大，為了達到分子影像學的要求，碳納米管的長度需要減短，以便于細胞的吸收，提高生物相容性以及實現最終在生物體內的消除。

2.1.2 超順磁性 超順磁性鐵氧化物(SPIO)由于具有較大的磁化率以及較低的毒性同樣受到廣泛的關注。Miyawaki等[15]把Fe3O4沉積到氧化的碳納米角的表面形成超順磁性的碳納米角。動物實驗表明，磁性納米角在磁共振成像中信號顯著減弱，且信號在脾臟以及腎臟隨時間變化。當劑量在8 mg/kg以下對小動物未表現任何毒性。磁共振成像技術雖然具有較高的空間分辨率，但較低的靈敏度限制了其在生物醫學以及分子成像領域的應用，開發具有更高成像性能的造影劑成為一條有效途徑。借助其良好的傳遞能力和對造影劑分子特殊的空間限制作用，碳納米管在磁共振成像中具有廣闊的應用前景。

2.2 近紅外成像

由于生物體在近紅外光區(NIR)基本上不產生熒光，而SWNTs卻能產生較強烈的熒光，因此能在復雜的生物體環境中被檢測。文獻[16，17]證明，SWNTs進入細胞以后仍然能夠觀察到其近紅外熒光信號，借此可研究碳管在注射入小動物以后的藥物動力學行為[18]，而碳管本身的拉曼光譜信號及熒光信號的改變能在不影響細胞的正常生長的情況下作為標記物長達3個月之久[17]。Choi等[19]以DNA包裹碳納米管鐵氧化合物的復合物，構成了具有磁共振成像以及近紅外熒光成像能力的雙功能化合物，經該復合物孵化的小鼠巨噬細胞不僅具有MRI信號，而且借助進入細胞內部的碳納米管的近紅外熒光能清楚觀察到細胞的邊界。除了活細胞，碳管的近紅外熒光還可以應用在活體成像上。Leeuw等[20]利用SWNTs所發射獨特的近紅外熒光，對果蠅活體內分布的SWNTs進行非破壞性成像(圖2)。實驗結果證明，攝入的SWNTs對果蠅沒有不良生理影響。Welsher等[21]在SWNTs表面分別修飾了Rituxan和Herception兩種抗體， 特異性地對表面具有相應受體的細胞進行近紅外成像，結果顯示在限制了碳管對生物體的非特異性鍵聯的情況下，由于抗體的存在，受體表達差異的不同細胞的近紅外信號具有較大的對比。由于SWNTs的近紅外熒光源自碳管本身的結構， 圖2 (a)果蠅幼蟲消化道內的SWNT和(b)果蠅幼蟲消化道內含SWNT的食物的近紅外熒光圖[20]

Fig.2 NIR image of SWNTs in the gut of a living larva(a) and Boluses of food containing SWNTs in a loop of the gut of a living larva(b)[20]因此不需要對碳管修飾其它熒光基團，同時具有較高的抗猝滅以及抗光漂白性能。然而，SWNTs的近紅外熒光要求碳管本身的結構完整，同時碳管需要呈單分散，因此只能以非共價作用力修飾碳管，這在一定程度上限制了其應用，可保證碳納米管對近紅外的吸收的更有效的修飾方法還有待研究。

2.3 正電子發射斷層掃描

傳統的醫學影像技術顯示的是疾病引起的解剖和結構變化，而正電子發射斷層掃描 (PET) 技術顯示的則是人體的功能變化，特別適用于在沒有形態學改變之前、早期診斷疾病、發現亞臨床病變以及評價治療效果。目前在腫瘤、冠心病和腦部疾病這3大類疾病的診療中尤其顯示出重要的價值。早期研究[22，23]證明PET可用于跟蹤碳納米管在活體中的分布。Liu等[24]以放射性核64Cu標記并以帶RGD肽段的磷脂通過非共價作用力修飾SWNTs，從而對癌細胞進行靶向，在荷瘤動物實驗中發現碳管能特異性的累積在癌細胞部位，從而呈現PET信號。McDevitt等[25]研究了以86Y標記的SWNTs在活體中的分布行為(圖3)，并通過共價鍵合放射性金屬螯合物，熒光基團以及特異性識別腫瘤細胞的單克隆抗體，從而實現對腫瘤細胞的選擇性多功能標記[26]。通過修飾的方法使碳管表面具有放射性信號，同時碳納米管具有較強的進入細胞的能力，結合PET顯示功能性變化的優點，可望應用于疾病的早期發現、診斷。

3 腫瘤細胞治療

3.1 載體

碳納米管能攜帶肽段、蛋白以及核酸等生物活性分子進入細胞而對細胞不產生毒性，因此可以作為一種治療腫瘤的有效載體。

3.1.1 肽段 肽段在分子生物學中有著重要的作用。研究證明，肽段可共價鍵合到SWNTs表面并保持其免疫學性質[27，28]。同時，肽段的存在可使碳管呈分散狀態，從而應用到生物醫學領域[29]。2004年Pantarotto[30，31]首次利用共聚焦熒光顯微鏡觀察經熒光標記的SWNTs將小肽段攜帶進細胞的過程，這一開創性工作為隨后該領域的眾多研究奠定了基礎。

3.1.2 蛋白 蛋白質可以通過非共價作用力[32]或共價作用力[34]連接在SWNTs表面，并可通過表面活性劑和聚合物對碳管的功能化來抑制蛋白在碳管表面的非特異性吸附[33]。Kam等[34]在SWNTs表面共價鍵合biotin并與熒光標記的streptavidin作用，發現該復合物能有效的把蛋白質以細胞內吞作用方式帶進細胞，不同的蛋白質能以非特異性作用吸附在經酸處理的碳管表面，進入細胞后更能夠發揮其生物學功能[35]。碳納米管進入細胞的機理目前還不盡清楚，普遍存在兩種觀點：與能量無關的主動插入擴散過程[30]和與能量有關的細胞內吞過程[34～36]。

3.1.3 核酸 核酸在生物醫學方面有極重要的作用。現已發現近2000種遺傳性疾病都和DNA結構有關，腫瘤的發生、病毒的感染、射線對機體的作用等都與核酸有關。通過共價鍵可以把核酸連接在碳管表面[37～39]，并能選擇性的對具有互補序列的DNA分子進行雜交[38，39]。

功能化碳納米管能通過靜電作用與質粒DNA結合并以較低的毒性穿透細胞膜從而被細胞吸收[40，41]，結合DNA的量則與碳管的表面積以及其所帶的靜電荷有密切關系[42]。Bianco的研究[43]證明，SWNTs能有效地攜帶含CpG基序的寡聚脫氧核苷酸CpGODN到目標細胞并能增強其免疫激活功能。此外，利用外磁場的驅動力誘導含鎳的碳納米管可有效的攜帶質粒DNA進入細胞，其轉染效率可達到過濾性病毒載體技術的水平[44]，而該方法同時具有相當高的生物相容性[45，46]。通常，DNA在碳管上的固定是通過靜電作用力完成的，因此只能形成亞穩定狀態的復合物，同時其轉染效率與碳管表面的化學基團的性質有很大的關系[47]。應用聚乙烯亞胺(PEI)、聚酰胺(PAMAM)等聚合物可以解決以上問題。Liu等[48]利用聚PEI使DNA牢固的結合在MWNTs表面，其轉染效率比PEI高3倍，而比單獨的DNA高4個數量級。潘碧峰等[49]探討了碳納米管PAMAM樹形分子遞送Survivin反義寡核苷酸ASONDs進入肝癌細胞及其對肝癌細胞增殖的影響，發現該復合物是高效的基因載體，并能有效抑制癌細胞的增殖。Jia等[50]把經量子點修飾的ASODNs與經PEI修飾的MWNTs管作用，構成集治療以及跟蹤標記的雙功能復合物。實驗結果顯示，該復合物具有較高細胞傳送效率、細胞核定位及轉染效率。

碳納米管同樣可作為RNA的載體。Lu等[51]通過放射性同位素標記表征以SWNTs為載體將RNA聚合物poly(rU)帶進細胞的過程。由于RNA聚合物與碳管是通過非特異性作用結合的，因此可以實現細胞內RNA的釋放。從不同深度的共聚焦顯微鏡圖片可以發現， 圖4 HeLa細胞(a)空白對比和(b)經SWNTsiRNA孵育后的共聚焦顯微鏡圖[52]

Fig.4 Confocal image of (a) untreated control henrietta lacks(HeLa) cells (b)HeLa cells incubated with SWNTsmall interfering ribonucleic acid(siRNA)[52]該復合物穿越了細胞膜以及核膜表面。通過特殊的化學鍵修飾，可以在細胞內的酶解下實現生物分子的可控性釋放。Kam等[52]利用二硫鍵在酶催化下裂解的性質，在SWNTs表面修飾了DNA及siRNA等生物分子，在細胞中實現DNA的傳送、釋放及核轉染，并實現對siRNA的高效傳遞以達到對細胞內特殊蛋白的基因沉默作用(圖4)。隨后在此基礎之上鍵合能使細胞膜受體CD4及細胞核受體CXCR4、CCR5發生基因沉默的RNA。該類受體是與HIV病毒相關的重要受體，以碳納米管作為siRNA的載體的傳遞能力遠遠超過脂質體等幾種現有的非過濾性病毒轉染劑，其轉染效率與碳管表面的化學基團以及親水性有關[52]。以碳管實現siRNA的傳遞同樣能抑制腫瘤細胞的生長。Zhang等[54]在碳管表面鍵合正電荷基團，與帶有負電荷的端粒酶逆轉錄酶TERTsiRNA通過靜電作用形成復合物， 提高siRNA在細胞內的穩定性以及導入細胞的效率，起到沉默免疫調節細胞中的靶基因的功效，并能在動物體內攜帶siRNA從而抑制腫瘤細胞的生長和增殖。

3.1.4 藥物 碳納米管作為藥物分子的載體的研究對于提高許多藥物的藥理學性質具有重要意義。Murakami等[55]利用氧化的碳納米角為抗炎性糖皮質激素地塞米松(DEX)的載體，成功地將DEX吸附在碳納米角上并在細胞中釋放。Venkatesan等[56]研究了碳納米管在內的多種多孔納米材料對促紅細胞生成素(EPO)吸附性能，動物實驗發現，在適當的表面活性劑的存在下碳管對EPO具有最高的吸附性能以及生物藥效。Bianco等在MWNTs表面鍵合熒光素(FITC) 和兩性霉素(AmB)，發現AmB能被有效的傳遞入細胞并保持其高度的抗真菌活性[57]，隨后的研究工作以相似的方法鍵合抗腫瘤藥物甲氨蝶呤(MTX)并成功導入細胞內[58]。Yu等[59]以促性腺素釋放素(GnRH)修飾MWNTs并驗證了其對前列腺癌細胞的殺滅性能。Feazell等[60]在SWNTs表面鍵合了四價鉑的配合物，隨后把配合物傳遞進細胞并借助細胞內的低pH值環境還原四價鉑，釋放出具有毒性的抗癌藥物順鉑(Cisplatin)，其傳遞效率是順鉑的6～8倍。后續研究是在鉑的配合物上分別修飾葉酸以及碳管，特異性地對癌細胞進行殺滅，其傳遞效率比鉑的配合物高兩個數量級[61]。除了可以把抗癌藥物修飾在碳管外表面，還可以通過納米沉淀技術填充到碳納米角的內部，其抗癌效果比順鉑高4～6倍[62]。除了葉酸，生物素同樣可作為靶向基團修飾碳納米管。Chen等[63]以生物素修飾的SWNTs將紫杉醇類毒素(Taxoid)特異性地攜帶進癌細胞，并利用可斷裂的化學鍵成功地在細胞內釋放。由于功能化碳管仍具有較大的憎水性表面，可與具有芳香環的分子以π堆積超分子作用力形成復合物。Liu等[64]把抗癌藥物亞德里亞霉素(DOX)與SWNTs分別形成共價與非共價復合物，結果表明，碳管對DOX比傳統的脂質體具有較高的藥物填充效率，并且在酸性環境下能快速釋放，其結合以及釋放的行為與碳管的直徑相關。同時通過鍵合具有靶向作用的RGD肽段，該復合物對RGD受體正表達的細胞具有較高的傳遞以及破壞能力。AliBoucetta等[65]以MWNTs進行了相似的研究，同樣證明了碳管能提高DOX對癌細胞殺傷效率。

3.2 熱破壞與放射治療

碳納米管同樣有望應用到硼中子俘獲治療(BNCT)技術中。BNCT是一種放射治療技術，利用超熱中子射線與預先注入體內并富集在腫瘤部位的特殊化合物中的硼元素發生強烈的核反應，釋放出殺傷力極強而射程很短的射線，從而特異性地殺滅癌細胞。Zhu等[66]將取代的碳硼烷共價修飾在SWNTs表面，經靜脈注射入荷瘤小鼠后能特異性的聚集在腫瘤部位并優先被腫瘤細胞吸收。BNCT的應用需要在碳管上修飾帶硼的基團或化合物在碳管上直接摻雜硼形成硼取代的碳納米管可能獲得更好的穩定性。

如前所述，SWNTs在近紅外光區不僅能發出較強的熒光同時還有較強的吸收，除了有望應用在腫瘤診斷以外，還具有腫瘤治療的潛在可能。Kam等[67]報道SWNTs在近紅外光下可以快速釋放多余的能量，形成細胞“炸彈”，由于大部分癌細胞表面葉酸受體的表達遠遠高于正常細胞，通過在碳管表面修飾葉酸，并對正常細胞進行近紅外線掃射，可在對正常細胞不造成傷害的情況下特異性的引起癌細胞的死亡 (圖5)，達到靶向治療的效果。除了近紅外光，碳納米管還可以吸收無線電波并放出熱量從而對腫瘤細胞進行破壞。Gannon等[46]研究了碳管對無線電波的吸收而引起的熱效應在不同癌細胞中的作用，并向動物的肝臟腫瘤注射經修飾的SWNTs，用無線電波對碳管進行加熱，成功地殺滅了腫瘤細胞，而對附近的健康細胞只造成了很少量的傷害。體外活細胞以及動物活體實驗的結果表明，碳管對癌細胞以及正常細胞的生長沒有明顯的影響，有望應用于癌癥射頻消融術(RFA)治療中，而下一步的研究則需要集中在靶向治療方面。

圖5 經近紅外激光照射后的(a)HeLa細胞和(b)正常細胞的光學圖片，經SWNT孵育后的(c)HeLa細胞和(d)正常細胞的共聚焦熒光圖(放大倍數: ×20) [67]

4 展 望

綜上所述，由于碳納米管具有獨特的一維結構，其外表面除了可以非共價力吸附各種分子，還可以鍵合多種化學基團以實現增溶及靶向，其內部空間則可以包埋離子以及小分子，并且能以最小的毒性穿越細胞膜，因此在生物醫學，包括藥物傳遞、分子影像、基因治療等方面具有較好的應用前景。當前，大部分研究集中在將碳納米管作為一種有效的腫瘤細胞載體來傳送造影劑、藥物以及具生物活性的分子，同時碳管能吸收特殊的激光以及射線進而轉化成熱量來破壞腫瘤細胞。后續研究的重點則應該集中在使碳納米管特異性的針對腫瘤細胞的診斷與治療，這就需要提高碳管的靶向作用，同時需要深入了解碳管進入細胞以及動物體內后的動態分布以及藥理性質。碳納米管的應用給腫瘤的診斷與治療帶來了新的機遇。然而，包括碳管在內的納米材料的安全性仍然值得高度的重視，如何合理安全的利用則面臨著新的挑戰。納米材料對人體和環境的毒性以及其機理仍然在研究之中，這就要求在臨床以及實際應用之前，需要充分考慮其生物相容性、細胞毒性、相關作用機理及防御措施，為更有效的應用奠定基礎。