作者：王元忠，劉鴻高，張金渝，李濤

【摘要】 目的建立絨柄牛肝菌的反相高效液相色譜定性和定量分析方法。方法反相高效液相色譜（RP-HPLC） Planetsil C18分析柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（15∶85），流速為1.0 ml·min-1，檢測波長為261 nm，柱溫為室溫。對絨柄牛肝菌有效部位（甲醇提取部位）進行指紋圖譜定性分析，對絨柄牛肝菌中的有效成分腺苷進行定量測定。結果在色譜條件下，11份不同絨柄牛肝菌中甲醇有效部位的RP-HPLC指紋圖譜中可檢出11個相對穩定的色譜峰，其中確定出9個共有峰作為定性鑒別的指標峰；絨柄牛肝菌中腺苷的含量為0.146%～0.493%。結論絨柄牛肝菌有效部位RP-HPLC指紋圖譜定性和有效成分定量分析方法具有較強的針對性和準確性，可用于絨柄牛肝菌及藥用真菌的質量控制。

【關鍵詞】 絨柄牛肝菌； 腺苷； 指紋圖譜； 反相高效液相色譜

絨柄牛肝菌Boletus tomentipes Earle，又名大巴菌、黑牛肝、毛腳牛肝菌，屬于擔子菌亞門（Basidiomyctina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricase）、牛肝菌科（Boletaceae）中的一種［1］。我國主要分布于云南，生于針闊葉林中地上，散生。全世界已知的牛肝菌屬約有1 024種或變種，我國已知的可食用的就有199種［2］。據文獻記載，牛肝菌子實體富含蛋白質、碳水化合物、鈣、磷、鐵、核黃素等營養成分，含有人體必需的8種氨基酸，還含有腺嘌呤(adenine)、膽堿(choline)和腐胺(putrescine)等生物堿，可治療腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐，還可治療婦女白帶癥［3］ 。牛肝菌子實體的水提物對小鼠肉瘤S180的抑制率達90%，對艾氏腹水癌的抑制率為80%，是中成藥“舒筋丸”的原料之一［4］。 眾多研究表明，同一物種不同個體由于來源和產地不同，其有效成分含量會有很大差異［5～7］。為了確保絨柄牛肝菌藥理作用，本研究建立了以絨柄牛肝菌有效部位為基礎的HPLC指紋圖譜定性分析和有效成分定量分析方法，并通過對11個不同地區的樣品分析測定研究，確定了絨柄牛肝菌指紋圖譜的共有峰和指標峰以及腺苷的含量范圍，為有效準確地定性和定量鑒別不同來源的大型藥用真菌提供一種分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-2010A高效液相色譜儀， SPD-M10Avp二極管陣列檢測器， CLASS-VP色譜工作站；色譜柱為Planetsil-C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm) ；色譜柱恒溫裝置。超純水器（Mill-Qplus USA）；KQ2200E型超聲波儀（舒美超聲儀）；AE100S萬分之一電子天平（梅特勒－托利多）。

流動相甲醇為色譜純（Fisher公司 美國）；水為三重蒸餾水（自制）；對照品腺苷（中國藥品生物制品檢定所提供）。其余所用試劑均為分析純。

1.2 材料來源

見表1。表1 實驗材料（略）

1.3 樣品制備腺苷標準溶液：精密稱取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的腺苷標準品，加甲醇制成每毫升含20 μg的溶液，作為對照品溶液。 取樣品粉碎混勻，準確稱取0.500 0 g試樣（精確至0.000 01 g）于心形瓶中，精密加90%甲醇10ml，70℃水浴回流提取30 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補足減失的重量，搖勻，以5 000 r/min離心5 min。經0.45 μm濾膜過濾后供液相色譜分析用。

2 結果

2.1 色譜條件色譜柱為Planetsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及其C18保護柱。流動相A為甲醇、流動相B為水；梯度洗脫；流速1 ml/min；檢測波長261 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μl。

2.2 分析方法學考察結果

2.2.1 系統適應性實驗吸取對照品溶液5 μl注入色譜儀，記錄色譜圖，理論塔板數按腺苷計算在5 000以上。在此條件下對腺苷對照品溶液，供試品溶液進行測定，供試品溶液色譜圖中與對照品溶液色譜圖相同位置具有吸收峰，且對照品測定無干擾。

2.2.2 線性關系考察

精密吸取2，4，6，8，10，12，14，16μl腺苷對照品溶液，按上述條件分別進樣，以腺苷濃度（mg/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸方程：Y=1.46×106 X-1.22×105，r2 =0.999 69，(n = 7)，表明腺苷在1.2～ 96 μg/ml范圍呈良好的線性關系。

2.2.3 儀器精密度和對照品溶液穩定性實驗精密吸取腺苷對照品溶液，在上述條件分別進樣6次，計算腺苷的峰面積，RSD＝0.678％，表明儀器精密度良好。 精密吸取腺苷對照品溶液，于配制后的0，2，4，8，14，26，48 h測定，其峰面積RSD＝1.04％，表明腺苷對照品溶液在48 h內穩定。

2.2.4 樣品溶液的穩定性實驗取同一批號的樣品，分別在0，2，4，8，14，26，48 h檢測指紋圖譜，各色譜峰的相對保留時間無明顯變化，單峰面積占總峰面積5％以上的色譜峰與參照峰的峰面積比值也無顯著變化。RSD＝1.454％，表明樣品溶液在48 h內穩定；儀器精密度可靠，符合指紋圖譜要求（國家藥監局，2000）。

2.3 指紋圖譜的建立分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀中，記錄60 min色譜圖即得。比較11批供試品的HPLC圖譜發現，其中有6個色譜峰是11批供試品所共有的。計算圖譜中各共有峰色譜峰相對于腺苷色譜峰（3號峰）的相對保留時間（a=ti/t8）和相對峰面積值（AR=Ai/A總×100%）。結果見表2～3。表2 不同地區絨柄牛肝菌HPLC圖譜主要峰相對保留時間比較（略）表3 不同地區絨柄牛肝菌HPLC圖譜主要峰相對保留時間比較（略）

2.4 共有峰確定在11份絨柄牛肝菌供試樣品的HPLC圖譜中，由色譜峰相對保留時間（a）的穩定性（相對偏差小于3%），可以確定的共有峰有9個，其相對保留時間從0.108 ～ 2.180；同時分別計算11個樣本主要峰的總面積（A總）、平均總面積（a總）以及總面積的相對偏差，舍去總面積相對偏差小于-40%的（樣品編號為3，4，10），最后其余樣本確定絨布牛肝菌共有峰1，3，5，6，7，8，9，10，11號峰，作為絨柄牛肝菌指紋圖譜定性分析的指標峰。用此定性指標鑒定11樣本，結果所有樣本均為絨柄牛肝菌。

2.5 絨柄牛肝菌中腺苷含量測定按“1.3”方法處理，進樣5 μl分析，測得峰面積積分值，計算絨柄牛肝菌中腺苷含量。結果見表4。

3 討論 RP-HPLC法雖然是一種有效的分離分析方法，但由于絨柄牛肝菌成分復雜，性質各異，即使使用梯度洗脫也很難獲得理想的分離結果。使用梯度洗脫增加了實驗操作和重現性難度，而且難以突出地反映藥用真菌與主要藥理作用相關的有效成分群，從而在質量控制方面無法有效地做到“綱舉目張”。本實驗應用反相高效液相色譜技術，建立了以絨柄牛肝菌指紋圖譜定性和有效成分定量的分析方法。這種方法是在物質基礎上，以絨柄牛肝菌為質控對象，并利用現代儀器分析技術同時進行定性和定量分析，增強了方法的有效性和針對性。實驗中采用等度洗脫方式，色譜條件容易控制，可保證分析結果的重復性。表4 不同地區絨柄牛肝菌中腺苷含量測定結果（略） 在色譜條件下，絨柄牛肝菌的HPLC圖譜中可以檢出11個色譜峰。通過對11份絨柄牛肝菌供試樣品的HPLC圖譜中主要峰相對保留時間（a）分析，其相對誤差（RSD）均小于3%，表明主要色譜峰在HPLC圖譜中的相對位置是穩定的，可以作為定性鑒別的指標參數；同時，測定各樣本主要峰的總面積（A總），以反映在不同樣本中的絕對含量，而各總面積的相對偏差則可以比較在不同樣本中的相對含量，舍去相對含量較小的樣本，由其余樣本確定了絨柄牛肝菌定性鑒別的指標峰有9個，相對保留時間分別為0.108，0.291，0.568，0.667，0.710，1，1.156，1.470，2.180，將其用于對11個樣本的定性鑒別。結果表明，雖然11個樣本中腺苷在含量上差別很大，但均含有9個指標峰，故認為它們是絨柄牛肝菌。 本研究選用腺苷作為標準品，據文獻資料報道，腺苷在大型真菌中的相對含量較為適中；腺苷為輔酶類藥物，它能參與體內能量代謝及蛋白質的合成，具有提高各種酶(特別是輔酶A) 的活性及改善機體代謝作用，因此是生物體生長代謝所必須、普遍存在的物質，以其作為標準品具有可比性。

在本實驗中，我們將11個樣本在相同實驗條件下，以腺苷為對照品，通過HPLC檢測出的腺苷成分含量在0.146%～0.493%之間。表明不同生長環境和貯藏時間對有效成分含量影響很大，絨柄牛肝菌質量須嚴格控制。在有效成分不完全明確的前提下，制定藥用真菌的指紋圖譜，對于有效地控制其質量，具有重要意義。 由于大型藥用真菌所含化學成分多而復雜，其來源品種、產地、生長過程、采收時間、儲藏條件等諸多因素對質量都有一定影響。大型藥用真菌質量的傳統評價方法已經不能滿足質量評價的需要，因此采用現代的科學技術建立大型藥用真菌定性定量標準已經非常必要和迫切。