作者：王元忠，劉鴻高，張金渝，李濤

【摘要】 目的建立絨柄牛肝菌的反相高效液相色譜定性和定量分析方法。方法反相高效液相色譜（RP-HPLC） Planetsil C18分析柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（15∶85），流速為1.0 ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為261 nm，柱溫為室溫。對(duì)絨柄牛肝菌有效部位（甲醇提取部位）進(jìn)行指紋圖譜定性分析，對(duì)絨柄牛肝菌中的有效成分腺苷進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果在色譜條件下，11份不同絨柄牛肝菌中甲醇有效部位的RP-HPLC指紋圖譜中可檢出11個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的色譜峰，其中確定出9個(gè)共有峰作為定性鑒別的指標(biāo)峰；絨柄牛肝菌中腺苷的含量為0.146%～0.493%。結(jié)論絨柄牛肝菌有效部位RP-HPLC指紋圖譜定性和有效成分定量分析方法具有較強(qiáng)的針對(duì)性和準(zhǔn)確性，可用于絨柄牛肝菌及藥用真菌的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 絨柄牛肝菌； 腺苷； 指紋圖譜； 反相高效液相色譜

絨柄牛肝菌Boletus tomentipes Earle，又名大巴菌、黑牛肝、毛腳牛肝菌，屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomyctina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricase）、牛肝菌科（Boletaceae）中的一種［1］。我國(guó)主要分布于云南，生于針闊葉林中地上，散生。全世界已知的牛肝菌屬約有1 024種或變種，我國(guó)已知的可食用的就有199種［2］。據(jù)文獻(xiàn)記載，牛肝菌子實(shí)體富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、鈣、磷、鐵、核黃素等營(yíng)養(yǎng)成分，含有人體必需的8種氨基酸，還含有腺嘌呤(adenine)、膽堿(choline)和腐胺(putrescine)等生物堿，可治療腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐，還可治療婦女白帶癥［3］ 。牛肝菌子實(shí)體的水提物對(duì)小鼠肉瘤S180的抑制率達(dá)90%，對(duì)艾氏腹水癌的抑制率為80%，是中成藥“舒筋丸”的原料之一［4］。 眾多研究表明，同一物種不同個(gè)體由于來(lái)源和產(chǎn)地不同，其有效成分含量會(huì)有很大差異［5～7］。為了確保絨柄牛肝菌藥理作用，本研究建立了以絨柄牛肝菌有效部位為基礎(chǔ)的HPLC指紋圖譜定性分析和有效成分定量分析方法，并通過(guò)對(duì)11個(gè)不同地區(qū)的樣品分析測(cè)定研究，確定了絨柄牛肝菌指紋圖譜的共有峰和指標(biāo)峰以及腺苷的含量范圍，為有效準(zhǔn)確地定性和定量鑒別不同來(lái)源的大型藥用真菌提供一種分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-2010A高效液相色譜儀， SPD-M10Avp二極管陣列檢測(cè)器， CLASS-VP色譜工作站；色譜柱為Planetsil-C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm) ；色譜柱恒溫裝置。超純水器（Mill-Qplus USA）；KQ2200E型超聲波儀（舒美超聲儀）；AE100S萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒－托利多）。

流動(dòng)相甲醇為色譜純（Fisher公司 美國(guó)）；水為三重蒸餾水（自制）；對(duì)照品腺苷（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）。其余所用試劑均為分析純。

1.2 材料來(lái)源

見(jiàn)表1。表1 實(shí)驗(yàn)材料（略）

1.3 樣品制備腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的腺苷標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成每毫升含20 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。 取樣品粉碎混勻，準(zhǔn)確稱取0.500 0 g試樣（精確至0.000 01 g）于心形瓶中，精密加90%甲醇10ml，70℃水浴回流提取30 min，放冷，再稱定重量，用90%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以5 000 r/min離心5 min。經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后供液相色譜分析用。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱為Planetsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及其C18保護(hù)柱。流動(dòng)相A為甲醇、流動(dòng)相B為水；梯度洗脫；流速1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。

2.2 分析方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)吸取對(duì)照品溶液5 μl注入色譜儀，記錄色譜圖，理論塔板數(shù)按腺苷計(jì)算在5 000以上。在此條件下對(duì)腺苷對(duì)照品溶液，供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，供試品溶液色譜圖中與對(duì)照品溶液色譜圖相同位置具有吸收峰，且對(duì)照品測(cè)定無(wú)干擾。

2.2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取2，4，6，8，10，12，14，16μl腺苷對(duì)照品溶液，按上述條件分別進(jìn)樣，以腺苷濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=1.46×106 X-1.22×105，r2 =0.999 69，(n = 7)，表明腺苷在1.2～ 96 μg/ml范圍呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 儀器精密度和對(duì)照品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取腺苷對(duì)照品溶液，在上述條件分別進(jìn)樣6次，計(jì)算腺苷的峰面積，RSD＝0.678％，表明儀器精密度良好。 精密吸取腺苷對(duì)照品溶液，于配制后的0，2，4，8，14，26，48 h測(cè)定，其峰面積RSD＝1.04％，表明腺苷對(duì)照品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 樣品溶液的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)的樣品，分別在0，2，4，8，14，26，48 h檢測(cè)指紋圖譜，各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，單峰面積占總峰面積5％以上的色譜峰與參照峰的峰面積比值也無(wú)顯著變化。RSD＝1.454％，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定；儀器精密度可靠，符合指紋圖譜要求（國(guó)家藥監(jiān)局，2000）。

2.3 指紋圖譜的建立分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀中，記錄60 min色譜圖即得。比較11批供試品的HPLC圖譜發(fā)現(xiàn)，其中有6個(gè)色譜峰是11批供試品所共有的。計(jì)算圖譜中各共有峰色譜峰相對(duì)于腺苷色譜峰（3號(hào)峰）的相對(duì)保留時(shí)間（a=ti/t8）和相對(duì)峰面積值（AR=Ai/A總×100%）。結(jié)果見(jiàn)表2～3。表2 不同地區(qū)絨柄牛肝菌HPLC圖譜主要峰相對(duì)保留時(shí)間比較（略）表3 不同地區(qū)絨柄牛肝菌HPLC圖譜主要峰相對(duì)保留時(shí)間比較（略）

2.4 共有峰確定在11份絨柄牛肝菌供試樣品的HPLC圖譜中，由色譜峰相對(duì)保留時(shí)間（a）的穩(wěn)定性（相對(duì)偏差小于3%），可以確定的共有峰有9個(gè)，其相對(duì)保留時(shí)間從0.108 ～ 2.180；同時(shí)分別計(jì)算11個(gè)樣本主要峰的總面積（A總）、平均總面積（a總）以及總面積的相對(duì)偏差，舍去總面積相對(duì)偏差小于-40%的（樣品編號(hào)為3，4，10），最后其余樣本確定絨布牛肝菌共有峰1，3，5，6，7，8，9，10，11號(hào)峰，作為絨柄牛肝菌指紋圖譜定性分析的指標(biāo)峰。用此定性指標(biāo)鑒定11樣本，結(jié)果所有樣本均為絨柄牛肝菌。

2.5 絨柄牛肝菌中腺苷含量測(cè)定按“1.3”方法處理，進(jìn)樣5 μl分析，測(cè)得峰面積積分值，計(jì)算絨柄牛肝菌中腺苷含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論 RP-HPLC法雖然是一種有效的分離分析方法，但由于絨柄牛肝菌成分復(fù)雜，性質(zhì)各異，即使使用梯度洗脫也很難獲得理想的分離結(jié)果。使用梯度洗脫增加了實(shí)驗(yàn)操作和重現(xiàn)性難度，而且難以突出地反映藥用真菌與主要藥理作用相關(guān)的有效成分群，從而在質(zhì)量控制方面無(wú)法有效地做到“綱舉目張”。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用反相高效液相色譜技術(shù)，建立了以絨柄牛肝菌指紋圖譜定性和有效成分定量的分析方法。這種方法是在物質(zhì)基礎(chǔ)上，以絨柄牛肝菌為質(zhì)控對(duì)象，并利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，增強(qiáng)了方法的有效性和針對(duì)性。實(shí)驗(yàn)中采用等度洗脫方式，色譜條件容易控制，可保證分析結(jié)果的重復(fù)性。表4 不同地區(qū)絨柄牛肝菌中腺苷含量測(cè)定結(jié)果（略） 在色譜條件下，絨柄牛肝菌的HPLC圖譜中可以檢出11個(gè)色譜峰。通過(guò)對(duì)11份絨柄牛肝菌供試樣品的HPLC圖譜中主要峰相對(duì)保留時(shí)間（a）分析，其相對(duì)誤差（RSD）均小于3%，表明主要色譜峰在HPLC圖譜中的相對(duì)位置是穩(wěn)定的，可以作為定性鑒別的指標(biāo)參數(shù)；同時(shí)，測(cè)定各樣本主要峰的總面積（A總），以反映在不同樣本中的絕對(duì)含量，而各總面積的相對(duì)偏差則可以比較在不同樣本中的相對(duì)含量，舍去相對(duì)含量較小的樣本，由其余樣本確定了絨柄牛肝菌定性鑒別的指標(biāo)峰有9個(gè)，相對(duì)保留時(shí)間分別為0.108，0.291，0.568，0.667，0.710，1，1.156，1.470，2.180，將其用于對(duì)11個(gè)樣本的定性鑒別。結(jié)果表明，雖然11個(gè)樣本中腺苷在含量上差別很大，但均含有9個(gè)指標(biāo)峰，故認(rèn)為它們是絨柄牛肝菌。 本研究選用腺苷作為標(biāo)準(zhǔn)品，據(jù)文獻(xiàn)資料報(bào)道，腺苷在大型真菌中的相對(duì)含量較為適中；腺苷為輔酶類藥物，它能參與體內(nèi)能量代謝及蛋白質(zhì)的合成，具有提高各種酶(特別是輔酶A) 的活性及改善機(jī)體代謝作用，因此是生物體生長(zhǎng)代謝所必須、普遍存在的物質(zhì)，以其作為標(biāo)準(zhǔn)品具有可比性。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們將11個(gè)樣本在相同實(shí)驗(yàn)條件下，以腺苷為對(duì)照品，通過(guò)HPLC檢測(cè)出的腺苷成分含量在0.146%～0.493%之間。表明不同生長(zhǎng)環(huán)境和貯藏時(shí)間對(duì)有效成分含量影響很大，絨柄牛肝菌質(zhì)量須嚴(yán)格控制。在有效成分不完全明確的前提下，制定藥用真菌的指紋圖譜，對(duì)于有效地控制其質(zhì)量，具有重要意義。 由于大型藥用真菌所含化學(xué)成分多而復(fù)雜，其來(lái)源品種、產(chǎn)地、生長(zhǎng)過(guò)程、采收時(shí)間、儲(chǔ)藏條件等諸多因素對(duì)質(zhì)量都有一定影響。大型藥用真菌質(zhì)量的傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法已經(jīng)不能滿足質(zhì)量評(píng)價(jià)的需要，因此采用現(xiàn)代的科學(xué)技術(shù)建立大型藥用真菌定性定量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)非常必要和迫切。