作者：戴學海，王華鈞，金法祥，陳秋美

【摘要】 目的 ：了解多重耐藥肺炎克雷伯菌氨基糖苷類修飾酶基因的存在狀況。方法 ：自2006年1月至2006年10月住院病人標本中分離并篩選出20株多重耐藥肺炎克雷伯菌，微量肉湯稀釋法檢測20種抗菌藥物的敏感性;PCR法檢測15種氨基糖苷類修飾酶基因。結果：20株多重耐藥肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類藥物慶大霉素、妥布霉素、奈替米星及阿米卡星耐藥率分別為75%、80%、65%和60%，其中氨基糖苷類修飾酶aac(3)-Ⅱ基因陽性15株，aac(6’)-Ⅰb基因陽性1株，ant(3”)-Ⅰ基因陽性16株，aph(3’)-Ⅰ基因陽性3株，ant(2”)-Ⅰ基因陽性1株。結論：多重耐藥肺炎克雷伯菌對氨基糖苷類藥物耐藥的主要原因是aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ib、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ和ant(2”)-Ⅰ等5種氨基糖苷類修飾酶基因的存在;從肺炎克雷伯菌中檢出aac(6’)-Ib-Cr型和aph(3’)-Ⅰ均為國內首次。

【關鍵詞】 肺炎克雷伯菌;氨基糖苷類修飾酶;多重耐藥性

Abstract: Objective: To understand the existence of genes encoding aminoglycoside modifying enzyme in multi-resistant Klebsiella pneumoniae. Methods: Samples of 20 strains of multi-resistant Klebsiella pneumoniae collected from the patients from January 2006 to October 2006 were isolated and screened out. The sensitivity of 20 antibacterial agents by means of broth induction was detected， and genes of aminoglycoside modifying enzyme by way of polymerase chain reaction were detected. Results: The resistance rates of 20 strains of multi-resistant Klebsiella pneumoniae to aminoglycoside，such as gentamicin，tobramycin，netilmicin and amikacin were 75%，80%，65% and 60%，respectively. Of which， 15 strains of aminoglycoside modifying enzyme aac (3’)-Ⅱ gene positive， 1 strain of aac (6’)-Ib，16 ones of ant (3”)-Ⅰ，3 ones of aph (3’)-Ⅰ and 1 strain of ant (2”) were found at the same time. Conculsion: The main reasons of multi-resistant Klebsiella pneumoniae resistance to aminoglycoside are the presence of aminoglycoside modifying enzymes called aac (3)-Ⅱ， aac (6”)-Ib， ant (3”)-Ⅰ， aph (3’)-Ⅰ and ant (2”)-Ⅰgenes. Genes of aac (6’)-Ib-Cr and aph (3’)-Ⅰ in Klebsiella pneumoniae are both first found and reported in China.

Key words: Klebsiella pneumoniae;aminoglycoside modifying enzyme;multidrug resistance

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae，KPN)已是醫院感染的重要病原菌。近年盡管國內已有KPN菌的氨基糖苷類藥物部分耐藥相關基因研究報道[1-2]，但報道所涉及耐藥相關基因較少。我們曾報道了一組老年患者KPN菌分離株β-內酰胺酶基因分型研究[3]，為進一步了解我院多重耐藥KPN菌氨基糖苷類藥物各種耐藥相關基因存在狀況，我們對20株分離自老年病房產β-內酰胺酶的KPN菌進行了15種氨基糖苷類修飾酶基因檢測，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 菌株來源及鑒定 20株均為分離自2006年1月-2006年10月間我院老年病房患者(年齡61～90歲)臨床標本，分別為：痰液13份，尿液6份，膽汁1份。全部菌株均使用ATB細菌鑒定儀鑒定菌種。

1.2 抗菌藥物敏感性試驗 藥敏試驗按美國CLSI 2006年版要求。質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、銅綠假單胞菌ATCC27853購自衛生部臨床檢驗中心，抗菌藥物敏感試驗采用微量肉湯稀釋法。

1.3 細菌處理 挑純培養菌落置入0.5 mL離心管內(內預置200 ng/mL蛋白酶K溶液200μL)，56℃水浴2 h，改95 ℃水浴10 min，離心(15 000 r/min)30 s。上清液即為基因檢測的模板液，-20 ℃冰箱保存備用。

1.4 基因PCR檢測 15種氨基糖苷類修飾酶基因檢測均為PCR法，靶基因引物序列和目的產物長度見表1。各種靶基因PCR擴增體系均為:每反應體系P1引物1μL(1.0μmmol/L)、P2引物1μL(1.0μmmol/L)，dNTPs 2μL(2 mmol/L)，10倍緩沖液2μL(KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO4 8 mmol/L，MgCl2 2 mmol/L，Tris-HCl(pH 9.0)10 mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(wt/vol))，Taq DNA pol 1 U(不計體積)，超純水9μL， 模板液5μL，總反應體積20μL。PCR擴增熱循環參數為：93 ℃預變性2 min，然后93 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，循環35周期，最后一個72 ℃延長至5 min。PCR產物長度>500 bp者PCR擴增熱循環參數為：93 ℃預變性2 min，然后93 ℃ 60 s→55 ℃ 60 s→72 ℃ 60 s，循環35周期，最后一個72 ℃延長至5 min。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，出現與陽性對照分子相當的目的條帶為陽性。檢測試劑盒和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

1.5 基因測序 PCR陽性產物為PCR直接全自動熒光法測序，委托上海博尚生物技術有限公司完成(測序在美國ABI公司3730型毛細管全自動測序儀上進行)。讀序工具軟件為Chromas，測序結果作BLASTn(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比對。

2 結果

2.1 抗菌藥物敏感性試驗 藥敏結果見表2。20株產β-內酰胺酶KPN菌對氨基糖苷類藥物慶大霉素、妥布霉素、奈替米星及阿米卡星耐藥率分別為75%、80%、65%和60%，表明可能存在多種氨基糖苷類修飾酶，使細菌耐受氨基糖苷類抗菌藥物;另外，對常見頭孢類抗生素，如頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟等全部耐藥，對亞胺培南敏感，驗證了超產β-內酰胺酶的前期結果，同時表明所有細菌都同時存在β-內酰胺類及其氨基糖苷類抗生素耐藥酶。

2.2 基因PCR檢測及其測序 20株KPN菌15種氨基糖苷類修飾酶基因檢測結果見表3。其中各抽取1株aac(6’)-I b、ant(2”)-I、aph(3’)-I PCR陽性產物進行測序，經BLASTn比對分別為aac(6’)-I b-Cr、ant(2”)-I、aph(3’)-I。其中，國內首次在KPN菌中發現的aac(6’)-I b-Cr、ant(2”)-I基因序列見圖1、2。

3 討論

氨基糖苷類抗菌藥物自1944年首次發現鏈霉素以來，一直是臨床上重要的抗感染藥物，因此類藥物抗菌譜廣、療效卓越，在臨床和畜牧獸醫業得到廣泛應用。但由于濫用和過度使用，耐藥問題隨之凸現，細菌對該類藥物有多種耐藥機制：通過產氨基糖苷類修飾酶(AME)、細菌16SrDNA基因甲基化酶(編碼基因為rmtA)和氨基糖苷類藥物作用靶位16SrDNA基因(16SrDNA)突變而致，其中前者為主要原因，氨基糖苷類修飾酶按功能可分成乙酰轉移酶(AAC)、核苷轉移酶(ANT)和磷酸轉移酶(APH)3類，目前已發現的有30余種。氨基糖苷類修飾酶是基因轉移酶，這些酶共價修飾抗菌藥物導致其結構變化，從而喪失與靶點的結合能力。國內有關革蘭陰性細菌，如鮑氏不動桿菌與銅綠假單胞菌氨基糖苷類藥物各種耐藥相關基因報道較多[4-5]，KPN菌氨基糖苷類藥物各種耐藥相關基因報道極少、所涉及耐藥相關基因較少[1-3]。

本研究20株分離自老年病房產β-內酰胺酶的KPN菌中有aac(3)-II、aac(6’)-I b、ant(3”)-I、aph(3’)-I、ant(2”)”I 5種基因陽性，氨基糖苷類藥物耐藥表型與基因型基本相符。2006年，美國學者Robicsek等[6]發現了不僅對氨基糖苷類藥物有修飾作用，而且對喹諾酮類藥物也有修飾作用的新氨基糖苷類修飾酶——aac(6’)-I b”Cr型。2007年國內學者從陰溝腸桿菌和大腸埃希菌中也查出aac(6’)-I b-Cr型[7-9]。本研究從產β-內酰胺酶的KPN菌中查出aac(6’)-I b-Cr型和aph(3’)-I基因均為國內首次。國內另有學者從KPN菌、大腸埃希菌中查出aac(6’)-I b基因家族新亞型[10-11]，我們將進一步積累菌株數完成流行病學研究。