【摘要】 目的 采用高效液相色譜法建立洋金花藥材的指紋圖譜。方法 以Zorbarx C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱，0.07 mol/L磷酸鈉溶液(用磷酸調(diào)pH 6.0，含17.5 mmol十二烷基硫酸鈉)-乙腈(2∶1)為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm。結(jié)果 本方法重復(fù)性及精密度良好；聚類分析結(jié)果顯示，南洋金花與北洋金花化學(xué)成分有明顯差異。結(jié)論 本法可有效控制洋金花藥材的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】 洋金花；指紋圖譜；氫溴酸東莨菪堿；高效液相色譜法

Key words：Flos Daturae；fingerprint；scopolamine；HPLC

2005年版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)收載洋金花為茄科植物白花曼陀羅Datura metel L.的干燥花。另外，地方用藥還有茄科曼陀羅屬(Datura)植物毛曼陀羅D.innoxia的花，前者稱為“南洋金花”，后者稱為“北洋金花”。洋金花屬劇毒藥品，具平喘鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛、解痙的功效，用于哮喘咳嗽、脘腹冷痛、風(fēng)濕痹痛以及外科麻醉等。迄今，洋金花中已被分離鑒定了39種生物堿和13種內(nèi)酯成分，其中主要有效成分為東莨菪堿和莨菪堿。目前國(guó)內(nèi)多采用滴定法[1]、薄層掃描法[2]、氣相色譜法及高效液相色譜法(HPLC)[3-4]對(duì)其中某個(gè)生物堿進(jìn)行分析，但不能有效控制藥材的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗(yàn)通過(guò)考察10批不同來(lái)源的洋金花藥材(包括南洋金花、北洋金花)，建立了指紋圖譜，并對(duì)不同種的洋金花測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了聚類分析。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 Series型高效液相色譜儀；氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)0049-9507，供含量測(cè)定用)；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

洋金花藥材由江蘇省藥品檢驗(yàn)所劉舞霞主任藥師進(jìn)行鑒定，分別為白花曼陀羅Datura metel L.或毛曼陀羅D.innoxia的干燥花，即南洋金花或北洋金花。詳見(jiàn)表1。

2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Zorbarx C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.07 mol/L磷酸鈉溶液(用磷酸調(diào)pH至6.0，含17.5 mmol/L十二烷基硫酸鈉)-乙腈(2∶1)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：216 nm。理論板數(shù)按氫溴酸東茛菪堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。色譜圖見(jiàn)圖1。表1 10批洋金花來(lái)源（略）

3 試驗(yàn)方法

3.1 參照物溶液的制備

由于洋金花中東茛菪堿含量高，且與其他成分分離較好，出峰時(shí)間適宜(保留時(shí)間為24 min左右)，故選東茛菪堿為參照物。精密稱取氫溴酸東茛菪堿對(duì)照品適量，用0.07 mol/L磷酸鈉溶液(用磷酸調(diào)pH至6.0)使溶解，制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備

取藥材粉末(過(guò)3號(hào)篩)約1 g，精密稱定，加入2 mol/L鹽酸溶液10 mL，超聲處理30 min(頻率：40 kHZ，功率：250 W，溫度：25～30 ℃)，放冷， 濾過(guò)，濾液用濃氨試液調(diào)pH值至14，用氯仿振搖提取4次，每次10 mL，合并氯仿液，置溫水浴上蒸干，殘?jiān)?.07 mol/L磷酸鈉溶液(用磷酸調(diào)pH至6.0)定量轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、10、15、24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明：峰面積比值占總峰面積5%以上的峰，其色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值基本一致，溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，在上述色譜條件下考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值的一致性。結(jié)果表明：峰面積比值占總峰面積5%以上的峰，其色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值RSD＜3%，符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。

3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份藥材，按上述供試品溶液制備方法平行制得5份供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果表明：峰面積比值占總峰面積5%以上的峰，其色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的比值RSD＜3%，符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求。

3.4 10批樣品HPLC指紋圖譜測(cè)定

取10批不同來(lái)源的洋金花藥材，按上述供試品溶液制備方法制備10份供試品溶液。精密吸取10份供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按照上述色譜條件記錄60 min的色譜峰。以氫溴酸東茛菪堿峰的保留時(shí)間及峰面積為1，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積比值。

4 10批洋金花藥材化學(xué)模式識(shí)別研究

4.1 原理

系統(tǒng)聚類法的基本思想是：先將n個(gè)樣本各自看成一類，然后規(guī)定樣本之間的距離。開(kāi)始，因每個(gè)樣本自成一類，類與類之間的距離是相等的，選擇距離最小的兩類或多類合并成一個(gè)新類，并計(jì)算該新類和其他類的距離，再將距離最近的兩類合并，這樣每次減少一類，直至所有樣本都成為一類為止。 類與類之間的距離有許多定義的方法，不同的定義就產(chǎn)生了系統(tǒng)聚類的不同方法。常用的有最短距離法、最長(zhǎng)距離法、中間距離法、重心法、類平均法、離差平方和法等。

4.2 方法與結(jié)果

將10批洋金花藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)分別讀入程序計(jì)算，采用歐氏最近距離及平均距離方法分別進(jìn)行聚類，范圍標(biāo)度化預(yù)處理，結(jié)果見(jiàn)圖2。 聚類分析結(jié)果表明：來(lái)源為武漢、蘇州的洋金花(經(jīng)專家鑒定為北洋金花)所含成分與其他來(lái)源的洋金花藥材(經(jīng)專家鑒定為南洋金花)所含成分的聚類距離最遠(yuǎn)，在歐氏最近距離聚類及歐氏平均距離聚類分析法中來(lái)源為武漢、蘇州的洋金花(北洋金花)所含成分距離接近并為一類。說(shuō)明不同種的洋金花藥材(南洋金花與北洋金花)成分有較明顯的差異，而同種的洋金花藥材間成分相對(duì)接近。

5 討論 以硅膠為基質(zhì)的反相鍵合填料表面不同程度地殘存硅醇基，殘存的硅醇基與待分離的堿性物質(zhì)相互作用而導(dǎo)致峰嚴(yán)重拖尾及分辨率降低。所以，反相HPLC法在生物堿的分析中常需調(diào)整流動(dòng)相的pH值，使用一定離子類型和濃度的緩沖液作為流動(dòng)相，并利用二次添加劑(主要指離子對(duì)試劑)改善分離。本試驗(yàn)采用離子對(duì)色譜技術(shù)，即在流動(dòng)相中加入十二烷基硫酸鈉作為對(duì)離子，在適當(dāng)pH值下與莨菪烷類生物堿結(jié)合形成離子對(duì)，從而使性質(zhì)相似的莨菪烷類生物堿在反相色譜系統(tǒng)中獲得適當(dāng)保留和較好分離。為了達(dá)到《中藥指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》中的規(guī)定，應(yīng)選擇出峰數(shù)目比較多、各共有峰響應(yīng)盡可能相當(dāng)者，作為指紋圖譜的測(cè)定波長(zhǎng)，以便表達(dá)更多的信息。本試驗(yàn)通過(guò)DAD檢測(cè)，選取216 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在此波長(zhǎng)處，各峰分離良好，且各峰響應(yīng)值均較大。 本試驗(yàn)通過(guò)考察10批不同來(lái)源的洋金花藥材，建立了指紋圖譜，并對(duì)不同種的洋金花測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了聚類分析。二種聚類分析結(jié)果基本一致，不同種的洋金花藥材(南洋金花與北洋金花)成分有較明顯的差異，而同種的洋金花藥材間成分相對(duì)接近。由于中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是各種化學(xué)成分的協(xié)同作用，所以，單純考察南洋金花與北洋金花中東茛菪堿成分的含量，不足以判斷臨床用藥上北洋金花是否可以替代南洋金花用藥。建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜準(zhǔn)確鑒別藥材對(duì)全面控制藥材質(zhì)量、指導(dǎo)臨床用藥具有很大的意義。

【參考文獻(xiàn)】 1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1985.228. [2] 何麗一.止咳喘熱參片中有效成分含量測(cè)定[J].中成藥研究，1986， 12(4)：8. [3] 葉崇義.洋金花藥材中東莨菪堿和莨菪堿氣相色譜法測(cè)定[J].中草藥， 1981，12(11)：13. [4] 于霖匯.反相高效液相色譜法測(cè)定洋金花藥材中東莨菪堿的含量[J].藥物分析雜志，1999，19(3)：174.