作者：衛(wèi)瑩芳，閆婕，王化東，郭山山

【摘要】 目的建立一種測定赤小豆中總黃酮含量的方法，為赤小豆的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法以蘆丁為對照品，亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定赤小豆總黃酮含量。結(jié)果線性方程為A=11.402C-0.004 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，平均加樣回收率為100.55%，RSD為1.36%(n=6)。對全國11個省的37個不同產(chǎn)地的藥材中總黃酮含量進(jìn)行了測定，赤豆含量為0.76%～1.31%，赤小豆含量為0.84%～1. 30%。結(jié)論該測定方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于赤小豆藥材中總黃酮的含量測定。

【關(guān)鍵詞】 赤小豆; 赤豆; 總黃酮; 蘆丁; 分光光度法

Abstract：ObjectiveTo develop a UV-VIS analysis method for the determination of total flavonoids in adzuki bean，in order to provide a scientific basis for the quality control of adzuki bean. MethodsWith rutin as standard sample， sodium nitrite - aluminum nitrate colorimetric method was used to determine the content of total flavonoids in adzuki bean.ResultsThe calibration curve of rutin was A=11.402C-0.004 9， r=0.999 9， and the average recovery was 100.55%，with RSD of 1.36%(n=6). The content range of total flavonoids in Phaseolus angularis was from 0.76% to 1.31%， and content range in P. calcaratus was from 0.84% to 1.30%.ConclusionThis detemination method is practical，reproducible and can be used for evaluating the quality of adzuki bean.

Key words： Adzuki bean; Total flavonoids; Rutin; UV-VIS spectrophotometry

赤小豆為豆科植物赤小豆Vigna umbeuata Ohwi et Ohashi或赤豆Vigna angularis Ohwi et Ohashi的干燥成熟種子，具有利水消腫，解毒排膿的功能[1]。赤小豆既是常用中藥，又是我國廣泛食用的豆類。中國的赤小豆資源極其豐富，是產(chǎn)量最多，出口量最大的國家。赤小豆始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其后歷代本草、醫(yī)方亦多有記載。現(xiàn)代藥理研究表明，赤小豆具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、抗菌、雌激素樣作用等藥理作用，廣泛應(yīng)用于臨床治療急性腎炎、肝硬化腹水、水痘、腮腺炎、炎性外痔、皮膚病等[2]。在中藥材安全性被日益關(guān)注的今天，其藥食同源的優(yōu)點使其備受青睞。赤小豆主要含有五環(huán)三萜皂苷類、黃酮類、鞣質(zhì)等化合物。其黃酮類化合物具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用，對Fe2+導(dǎo)致的大鼠原代肝細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，是預(yù)防和治療腫瘤、肝病等疾病的有效成分[3]。《中國藥典》現(xiàn)行版收載赤小豆質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)極不完善，缺乏內(nèi)在質(zhì)量量化指標(biāo)。本文用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法建立赤小豆總黃酮含測方法，并對全國11省37個產(chǎn)地的赤豆、赤小豆總黃酮含量進(jìn)行了測定，為完善制定赤小豆質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 材料赤豆藥材29份，赤小豆藥材8份，由成都中醫(yī)藥大學(xué)閆婕、郭山山、王化東等自采或購于全國11個省區(qū)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)衛(wèi)瑩芳教授鑒定為豆科植物赤豆Vigna angularis Ohwi et Ohashi或赤小豆Vigna umbeuata Ohwi et Ohashi的干燥成熟種子。

1.2 儀器UV-1100紫外-可見分光光度儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司)，DZKW-4電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，KQ-3200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BP121S電子天平(萬分之一 Startorius德國賽多利斯股份公司)，BP211D電子天平(十萬分之一 Startorius德國賽多利斯股份公司)。

1.3 試藥蘆丁對照品(批號：100080-200707，購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用);其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯色方法及測定波長的選擇精密吸取蘆丁對照品溶液和供試品溶液適量，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法進(jìn)行顯色，以空白試劑為對照，于200～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，在500nm處有最大吸收，故選500 nm為測定波長。見圖1。

2.2 對照品溶液的配制取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品25 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻。精密量取20 ml，置50 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得每毫升中含無水蘆丁0.2 mg的蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取對照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，分別置25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1ml，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1ml，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在500 nm波長處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為A=11.402C-0.004 9，r=0.999 9，蘆丁在0.008 184～0.049 104 mg/ml濃度范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。見圖2。圖1 赤豆最大吸收波長光譜圖圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度實驗精密吸取蘆丁對照品溶液適量于具塞試管中，平行6份，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。測定結(jié)果的RSD為0.98%，儀器的精密度較好。

2.5 穩(wěn)定性實驗精密吸取蘆丁對照品溶液適量于具塞試管中，按照“2.3”項下方法顯色，顯色后放置5，10，15，30，45，60，90，120 min后，吸光度分別為0.487，0.486，0.484，0.483，0.480，0.479，0.475，0.472。結(jié)果表明該顯色反應(yīng)在5～120 min內(nèi)較穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性實驗取同一批赤小豆樣品約1.0 g，平行6份，精密稱定，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。6次重復(fù)試驗的測定結(jié)果平均值為0.630，RSD為1.39%，該方法有較好的重復(fù)性。

2.7 加樣回收率實驗精密稱取蘆丁對照品25.03 mg，用70%乙醇定容于50 ml量瓶中備用。稱取已知含量的赤豆粉末0.5g，平行6份，精密稱定，精確加入新制備的對照品溶液5 ml，混勻，加入70%乙醇35 ml，水浴回流1.5 h，濾過，濾液轉(zhuǎn)移置50 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，精密吸取5 ml至25 ml量瓶中，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。結(jié)果見表1。平均加樣回收率為100.55%，RSD為1.36%(n=6)。表1 加樣回收率實驗結(jié)果

2.8 供試品溶液制備方法的選擇

2.8.1 提取溶劑考察取同一赤豆粉末約1.0g，平行8份，精密稱定，分別加入30%乙醇，50%乙醇，60%乙醇，70%乙醇，80%乙醇，水，甲醇，40%甲醇各25 ml，超聲提取20 min，濾過，精密移取濾液3 ml，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。結(jié)果(見表2)表明，采用不同提取溶劑，吸光度的差異較大，水和甲醇做溶劑的吸光度極低，50%以下濃度的乙醇難以過濾。

2.8.2 溶劑用量考察取同一赤豆粉末約1 g，平行4份，精密稱定，各加8，16，25，50倍量70%乙醇，分別超聲提取20 min，濾過，精密移取濾液5 ml，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。結(jié)果表明，溶劑用量對吸光度有較大影響，隨著溶劑用量的增加，吸光度也相應(yīng)增加。見表3。表2 提取溶劑的考察結(jié)果表3 溶劑用量的考察結(jié)果

2.8.3 提取方法考察取同一赤豆粉末約1 g，平行2份，精密稱定，各加25 ml 70%乙醇，分別以超聲、回流提取30 min，濾過，精密移取濾液3 ml，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。吸光度分別為0.304，0.611。結(jié)果表明，相同條件下，回流提取方法要明顯優(yōu)于超聲提取。

2.8.4 提取時間考察取同一赤豆粉末約1 g，平行4份，精密稱定，各加25 ml 70%乙醇，分別以80℃回流提取30 min，1，1.5，2 h，濾過，精密移取濾液3 ml，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。結(jié)果(見表4)表明，提取時間為0.5 h的吸光度最低。表4 提取時間的考察結(jié)果

2.8.5 回流溫度取同一赤豆粉末約1 g，平行4份，精密稱定，各加25 ml 70%乙醇，分別在60，70，80，90℃水浴溫度下回流1 h，濾過，精密移取濾液3 ml，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。吸光度分別為0.521，0.576，0.550，0.530。結(jié)果表明，70～80℃為最佳回流溫度。

2.8.6 pH值取同一赤豆粉末約1 g，平行4份，精密稱定，各加25 ml 70%乙醇，分別調(diào)節(jié)pH值到6，7，8，9，10，于80℃水浴溫度下回流1 h，濾過，精密移取濾液3 ml，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。吸光度分別為0.579，0.550，0.571，0.503。結(jié)果表明，不同pH值，對吸光度影響不大。

2.8.7 正交實驗根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇乙醇濃度(A)、溶劑量(B)、提取時間(C)為3個因素，每個因素選用3個水平設(shè)計“乙醇回流提取因素水平表”，見表5。以用L9(34)正交表任意安排因素，作3次重復(fù)實驗。取同一赤豆粉末約1 g，精密稱定，置錐形瓶內(nèi)，按因素水平表及正交設(shè)計表進(jìn)行乙醇回流提取，提取液過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中，加適當(dāng)?shù)娜軇┲量潭龋瑩u勻，作為供試品儲備液。精密量取儲備液5 ml，置25 ml容量瓶中，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。采用SPSS15.0對試驗結(jié)果進(jìn)行正交設(shè)計試驗分析，以確定最佳提取條件，結(jié)果見表6。表5 乙醇回流提取因素水平表6 乙醇回流提取正交設(shè)計及試驗結(jié)果吸光度越大，黃酮的提取率就越高。方差分析表明，乙醇濃度(A)、溶劑量(B)對黃酮提取率有極顯著影響(P<0.01)，提取時間(C)對黃酮提取率無顯著影響(P>0.05)。重復(fù)試驗P>0.05，三次重復(fù)實驗無顯著差異。直觀分析R值表明，影響赤豆提取率的主次因素分別為B>A>C，最佳提取工藝是A2B3C2，即用70%的乙醇35 ml，回流提取1.5 h。

2.9 不同產(chǎn)地赤豆、赤小豆樣品中總黃酮的含量測定取各個產(chǎn)地的赤小豆及赤豆藥材粉末約1.0 g，精密稱定，置250 ml錐形瓶中，加70%乙醇35 ml，于水浴溫度75℃回流提取1.5 h， 放冷，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至5 0ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，作為供試品儲備液。精密量取5 ml供試品儲備液置25 ml容量瓶中，按照“2.3”項下方法顯色測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品溶液總黃酮含量。結(jié)果見表7。

3 討論

總黃酮是赤小豆抗氧化、預(yù)防各種慢性疾病的活性成分。本文建立了亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定赤小豆藥材中總黃酮的含量的方法，并研究了赤小豆總黃酮的制備方法，對提取方式、提取溶劑、溶劑用量等進(jìn)行考察，最終確定提取條件為用35倍量的70%的乙醇，回流提取1.5 h。方法學(xué)研究結(jié)果表明，該含量測定方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好(RSD為1.39%)，加樣回收率為100.55%，RSD為1.36%。因此本方法可作為赤小豆總黃酮的含量測定方法。表7 全國不同產(chǎn)地赤豆、赤小豆總黃酮的含量全國8省，29個產(chǎn)地赤豆樣品中總黃酮的含量在0.76%～1.31%，陜西省平遙縣西善鄉(xiāng)的總黃酮含量高于其他地區(qū)，達(dá)1.31%，四川省荷花池藥材市場購德陽產(chǎn)商品的含量最低，只有0.76%。全國5省，8個產(chǎn)地的赤小豆樣品中總黃酮的含量在0.84%～1.30%，購于清平藥材市場的總黃酮含量最高，為1.30%，貴州省黔東南苗族侗族自治區(qū)的含量最低，為0.84%。建議赤小豆藥材總黃酮含量不得低于0.80%。

當(dāng)年自采的樣品大多含量較高，商品藥材有些含量偏低，是否與商品藥材貯藏時間久，蟲蛀現(xiàn)象有關(guān)，值得深入研究。藥用赤小豆的貯藏方法及貯藏年限需要進(jìn)一步加以規(guī)范。