作者：席萍 黃耀海 黃月純 蔡慶群 曹艷芳

【摘要】 目的建立五指毛桃藥材的高效液相(HPLC)指紋圖譜。方法采用高效液相色譜法，選用XDB－C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。 柱溫25℃；檢測波長246 mm。流動相為甲醇-水。梯度洗脫：0 min，甲醇-水（15∶85）；20min，甲醇-水（55∶45），40 min；甲醇-水（85∶15）；45 min，甲醇-水（100∶0）；50 min，甲醇-水（15∶85）。流速1 ml/min；運行時間50 min；檢測波長為246 nm。結果五指毛桃藥材共有9個共有峰。 結論實驗方法可行，可為檢測五指毛桃藥材質量控制標準提供參考。

【關鍵詞】 五指毛桃 指紋圖譜 高效液相色譜法

五指毛桃（Radix Fici）為桑科植物粗葉榕Ficus hirta Vahl.的干燥根。最早稱為無爪龍，記載于清代的《生草藥性備要》，目前臨床使用習稱五爪龍，許多現代大型中藥工具書稱之為五指毛桃，商品名亦稱五指毛桃［1］。2004年版《廣東省中藥藥材標準》將其以五指毛桃的名稱列入標準中［2］。本品為華南地區常用中藥材，味甘，性平，有健脾補肺、利濕舒筋功能，主治脾虛浮腫、食少無力、肺癆咳嗽、盜汗、帶下、產后無乳、風濕痹痛、水腫、肝硬化腹水、肝炎、跌打損傷，臨床療效顯著。梅州地區宜將其作為食療常用品，家喻戶曉。研究表明五指毛桃藥材的化學成分主要是補骨脂素以及佛手內酯、油酸、亞油酸、十六酸、十八酸等成分，這些成分在沸水中煎出均能產生香氣，民間習慣以其香味的濃郁程度來判斷其質量的優劣。 據文獻檢索有關五指毛桃的栽培技術研究［3］，組織培養研究［4］、揮發油成分的分析［5，6］、以及測定其成分含量的薄層掃描法研究［7］等均有報道。但對五指毛桃藥材指紋圖譜的研究卻未見報道，為更好地評價五指毛桃藥材質量的均勻性和穩定性，提高其質量控制標準 ，我們收集了不同產地五指毛桃藥材，采用高效液相色譜法，建立了五指毛桃藥材的指紋圖譜分析方法。

1 器材

1.1 儀器高效液相色譜儀 (HP-1100，安捷倫) ；二極管陣列檢測器（DAD）；色譜柱：XDB－C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷倫）。

1.2 試藥甲醇(色譜試劑，批號051105101，天津市四友生物醫學技術有限公司)；水為超純水；補骨脂素對照品（739-200209） (由中國藥品生物制品檢定所提供)；樣品：五指毛桃藥材共9批（見表1），均為當年新鮮采集曬干，委托廣州致信中藥飲片公司在各地收集并鑒定。見表1。

表1 五指毛桃藥材來源（略）

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersi1 ODS(250 mm×4.0 mm；5 μm)；流動相，甲醇-水；梯度洗脫條件：0 min，甲醇-水（15∶85）；20 min，甲醇-水（55∶45）；40 min，甲醇-水（85∶15）；45 min，甲醇-水（100∶0）；50 min，甲醇-水（15∶85）；流速，1 ml/min；柱溫為室溫；進樣量，10 μl；檢測波長246 nm。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取補骨脂素對照品0.79 mg，加甲醇制成0.395 mg/ml的溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備稱取五指毛桃藥材粉末約5 ｇ，置錐形瓶中，加入甲醇50 ml，浸泡過夜，超聲處理30 min，濾過。濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，定容至1 ml。

2.4 測定方法分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄50 min的色譜圖。

3 結果

3.1 精密度實驗取同一份供試品溶液，連續進樣5次，其色譜峰保留時間的RSD均在0.3%以內，峰面積的RSD均在5%以內。保留時間和峰面積基本無明顯變化，符合指紋圖譜技術要求。

3.2 穩定性實驗取同一份供試品溶液，分別在0，2，4，6，12 h處檢測，其色譜峰保留時間的RSD均在0.2%以內，峰面積的RSD均在5%以內。表明樣品溶液在12 h內穩定。

3.3 重復性實驗取同一批樣品如法制備供試品5份檢測，其色譜峰保留時間的RSD均在0.3%以內，峰面積的RSD均在5%以內。保留時間和峰面積基本無明顯變化，表明方法重現性較好。

3.4 主要色譜峰的建立分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄50 min的色譜圖。檢測指認結果9批五指毛桃藥材的指紋圖譜，與參照物補骨脂素的色譜峰（S）相對應的位置上，有一主要色譜峰，其占總峰面積的百分比約為50.26％～62.27％。50 min內有9個色譜峰是9批五指毛桃共有的。其在5號峰和6號峰（保留時間約在23.5 min和27 min）的位置更具有特征性，為主要共有峰，5號峰對應為補骨脂素的色譜峰（S）。因此，最終確定9個色譜峰為共有指紋峰見圖1，共有指紋峰的保留時間見表2，峰面積百分含量見表3。

圖1 五指毛桃藥材色譜峰圖（略）

表2 9批五指毛桃樣品共有指紋峰的保留時間（略）

表3 指紋圖譜主要共有峰的峰面積百分含量（略）

3.5 樣品指紋圖譜相似度分析 五指毛桃9批藥材樣品指紋圖譜與相似度計算機軟件（SPSS）得出的共有模式相比較，其相似度結果見表4。

4 討論 由于五指毛桃藥材成分復雜，實驗中選擇單一流動相無法達到很好的分離效果，而采用梯度洗脫可以在整個分析時間段（50 min）內，各色譜峰峰形尖銳，并能盡可能多地對各組分進行很好的分離，達到較好分離效果。我們考察了甲醇－水不同比例以及不同洗脫梯度的試驗，結果表明，本實驗所采用的流動相：0 min，甲醇-水（15∶85）；20 min，甲醇-水（55∶45）；40 min，甲醇-水（85∶15）；45 min，甲醇-水（100∶0）；50 min，甲醇-水（15∶85）。其分離效果較好。 在檢測波長的選擇中，采用二極管陣列檢測器（DAD）檢測，在215，246，270，290和320 nm中的色譜圖進行比較，結果在246 nm處的色譜圖中出峰較多，峰形較好，而且是五指毛桃藥材主要成分補骨脂素的最大吸收波長，因此我們選取246 nm作為其指紋圖譜的檢測波長。

表4 與共有模式比較的五指毛桃樣品相似度評價（SPSS軟件）（略）

實驗中制備五指毛桃樣品液，我們選擇7種提取溶劑系統即50%甲醇，甲醇，乙醇，醋酸乙酯，乙醚，氯仿，石油醚進行考察。結果顯示在同樣超聲30 min的情況下，以甲醇的提取效果最佳。而對提取方法的考察，以甲醇為提取溶媒，分別采用浸泡24 h，加熱回流2 h，索氏提取4h和超聲提取30 min等4種提取方法的提取效率，發現甲醇熱回流和甲醇超聲提取對五指毛桃藥材進行處理所得色譜圖峰數較多，更能體現藥材原有的面貌。經過實驗比較，用甲醇超聲提取30 min的操作相對簡單，效果較佳，最后選定其作為本實驗的提取方法。 實驗結果顯示，五指毛桃1～7號樣品相似度均達到95%以上，說明其指紋圖譜具有較高的相似性。8～9號樣品相似度偏低，與其藥材中參雜較多的莖枝部分有關。五指毛桃的藥用部位主要是根，但據市場情況來看，不同地區采用根莖混用的情況是存在的。 測定結果表明，不同產地的五指毛桃藥材指紋圖譜的9個共有峰保留時間，均具有較好的重現性； 其中，1號樣品各號峰均齊全，共有峰面積大，5號峰和6號峰的峰面積百分含量高，初步認為它的質量最好，這與有關河源產地的五指毛桃質量檢測最佳的研究報道相符［8］；同樣源于河源產地的2號樣品，其各號峰也較齊全，但與樣品1相比，其4號峰異常的高，且缺少8號峰，由于它們分別購于不同的時間段，究竟是何原因造成這種差異，有待日后的調查研究。 因實驗條件限制，我們沒能在各個產地采集多批次的樣品進行試驗，本實驗也只是對五指毛桃藥材指紋圖譜作初步的探討研究，為提高其質量控制標準提供檢測方法。