作者：李成仁 王園園 李小艷 宋曉虹 韋琪生 蔣林 葉創興

【摘要】 目的確定腫節風藥材的采收部位與最佳采收期。方法分別將采得的不同季節腫節風藥材分為根、莖、葉3部分，以60%乙醇為溶劑回流提取。采用高效液相色譜法測定不同季節腫節風藥材各部位中反丁烯二酸和異嗪皮啶的含量；以紫外分光光度法測定其總黃酮的含量。結果腫節風藥材葉中總黃酮含量最高，莖中反丁烯二酸含量最高，根中異嗪皮啶含量最高，綜合考慮3種有效成分，以6月、8月含量最高。結論6月、8月份為腫節風藥材的最佳采收期，以全株采收為宜。

【關鍵詞】 腫節風 藥效成分 采收期 采收部位

腫節風為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai的干燥全草，又名九節茶、接骨木等，主要分布于我國華南、華東、西南各省區，在朝鮮、日本、東南亞和印度也有分布。《中國藥典》2005 年版（Ⅰ部）中記載其具有清熱涼血、活血消斑、祛風通絡的功效，可用于治療血熱紫斑、紫癜、風濕痹痛、跌打損傷等癥［1］。現代藥理學實驗表明，腫節風具有抗菌消炎、抗腫瘤等作用，已制成各種劑型用于各種炎癥和癌癥的輔助治療。其主要藥效成分為反丁烯二酸、異嗪皮啶和黃酮類化合物［2］。腫節風中反丁烯二酸和異嗪皮啶的含量可采用高效液相色譜法進行測定［3，4］，黃酮類化合物可通過紫外分光光度法測定［5］。本實驗采取3種藥效成分同時考察的方法，對不同生長季節的腫節風以及不同部位藥用價值進行評估，為腫節風藥材的采收提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀（Waters515泵，Waters 2487紫外檢測器），恒奧HT-230A柱溫箱（天津恒奧公司），YH3000色譜工作站（廣州逸海公司）。TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

1.2 試藥 反丁烯二酸對照品（批號：1541-200001），異嗪皮啶對照品（批號：110837-200304），蘆丁對照品（批號：100080-200）購于中國藥品生物制品檢定所。乙腈（色譜純，Merck公司），磷酸（色譜純，Fluka公司），Mili-Q超純水，其余試劑均為分析純。 腫節風藥材采于廣西東蘭縣腫節風藥材GAP基地，自2007-05～2007-12每月采全株樣，根、莖、葉分開，60℃下烘干。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 總黃酮對照品溶液精確稱取蘆丁對照品20 mg，置于50 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.4 mg/ml蘆丁對照品溶液［5］。

2.1.2 反丁烯二酸與異嗪皮啶對照品溶液精確稱取反丁烯二酸對照品7.5 mg，異嗪皮啶對照品1.8 mg，置25 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液( 含反丁烯二酸0.3 mg/ml，異嗪皮啶0.072 mg/ml) 。

2.2 供試品溶液的制備準確稱取干燥，粉碎，過3號篩的腫節風藥材根、莖、葉粉末各0.5 g，置250 ml燒瓶中，按1∶30的料液比分別加入60%乙醇回流提取1 h，過濾后重復提取2次，合并濾液，減壓濃縮至干，以蒸餾水溶解殘物，定容至25 ml，備用。

2.3 總黃酮測定波長的選擇取蘆丁對照品溶液0.5 ml，置10 ml容量瓶中，用30%的乙醇補充至5 ml，加入5%NaNO2溶液0.3 ml，放置5 min，加入10%Al(NO3)3溶液0.3 ml，6 min后加入4%NaOH溶液2.0 ml，此時溶液顯紅色，混勻后以30%乙醇稀釋至刻度，靜置10 min后于紫外分光光度計下進行全波長光譜掃描，在500 nm處有最大吸收值，因此以500 nm作為總黃酮的檢測波長。

2.4 色譜條件色譜柱為Agilent Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為0.05%磷酸水溶液；流動相B為乙腈；檢測波長210 nm；柱溫35℃。梯度條件0～8 min流動相B 5%；8～30 min B5%～12%；30～45 min B12%～19%。經測試，樣品峰分離度在1.5以上，反丁烯二酸理論塔板數在5 000以上，異嗪皮啶理論塔板數在10 000以上。

2.5 標準曲線的繪制

2.5.1 總黃酮標準曲線分別取蘆丁對照品溶液0，0.25，0.5，0.75，1.25，1.5 ml于10 ml的容量瓶中，按“2.3”項下方法處理后，于紫外分光光度計下測定吸光值，檢測波長500 nm。以標樣濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程Y=9.497 5X+0.0413， r=0.999 9，線性范圍：0.01～ 0.06 mg/ml。

2.5.2 反丁烯二酸與異嗪皮啶標準曲線精確吸取體積為0.04，0.2，0.4，2，4，6，8 ml的反丁烯二酸與異嗪皮啶混合對照品溶液于25ml的容量瓶中，加水稀釋至刻度，定容后以0.45 μm微孔濾膜過濾，精確吸取20 μl，注入高效液相色譜儀測定。以進樣質量為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，分別得反丁烯二酸和異嗪皮啶的回歸方程為：Y=6 966 848.636 2X+702 737.286 7，r=0.999 6；Y=14 391 526.525 4X+221 002.013 3，r=0.999 8；線性范圍：反丁烯二酸0.024 ～ 4.8 μg；異嗪皮啶0.006～1.152 μg。

2.6 方法學考察

2.6.1 總黃酮方法學考察 精密度實驗：取腫節風藥材全株樣品，按“2.2”項下所述方法制備樣品溶液，按“2.3”項下方法處理并測定500 nm處吸光值，連續測量5次，以總黃酮含量計算，RSD為2.49%，表明該法精密度良好。 重復性實驗：取同一批藥材全株樣品6份， 按“2.2”項下所述方法法制備樣品溶液，按“2.4”項下所述方法進行測定，以總黃酮含量計算，RSD =2.53 %，表明方法的重復性良好。 穩定性實驗：取同一批藥材全株樣品，按“2.2”項下所述方法法制備樣品溶液，3 h內每隔30 min以“2.3”項下方法進行測定，其結果RSD =1.58 %，表明樣品在3 h內穩定。 加樣回收率實驗：取已知含量的腫節風樣品，加入一定量對照品，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.3”項下方法處理后測定吸光值，得總黃酮的平均回收率為101.8%， RSD=3.44%。

2.6.2 反丁烯二酸與異嗪皮啶方法學考察 精密度實驗：取腫節風藥材全株樣品，按“2.2”項下所述方法制備樣品溶液，重復進樣5次，記錄峰面積比值，反丁烯二酸和異嗪皮啶的RSD值分別為1.43%和2.35%，表明儀器的精密度好。 重復性實驗：取同一批腫節風藥材樣品 6 份，按“2.2”項下所述方法制備樣品溶液，分別注入高效液相色譜儀進行分析，反丁烯二酸RSD = 4.64 %；異嗪皮啶RSD = 4.13%，表明方法的重復性較好。 穩定性實驗：取腫節風藥材樣品溶液在0，2，4，8，24，48 h 分別進樣分析，反丁烯二酸和異嗪皮啶的RSD分別為1.93%和3.02%，表明樣品在48 h內穩定。 加樣回收率實驗：取已知含量的腫節風藥材樣品，加入一定量對照品，按“2.2”項下制備樣品溶液的方法處理，注入高效液相色譜儀進行分析，測得反丁烯二酸的平均回收率為101.8% ， RSD = 3.53 %；異嗪皮啶的平均回收率為99.9%，RSD=3.44%。

2.7 樣品中有效成分含量的測定

2.7.1 總黃酮含量的測定精確吸取0.5 ml樣品溶液，按“2.3”項下方法依次進行測定。以吸光值代入回歸方程進行計算。 各月份不同部位的總黃酮含量見表1。

表1 5～12月份腫節風藥材不同部位總黃酮含量（略）

2.7.2 反丁烯二酸與異嗪皮啶含量的測定精確吸取樣品溶液20 μl注入液相色譜儀，按“2.4”項下色譜條件進行測定（對照品與樣品色譜圖見圖1～2），以峰面積代入回歸方程計算。各月份不同部位的反丁烯二酸與異嗪皮啶含量見表2～3。

圖1 混合對照品溶液色譜圖（略）

圖2 腫節風樣品溶液色譜圖（略）

表2 5～12月份腫節風藥材不同部位反丁烯二酸含量（略）

表3 5～12月份腫節風藥材不同部位異嗪皮啶含量（略）

3 討論

3.1 腫節風藥材不同部位的有效成分含量對比表1～3中分別列出了腫節風不同部位總黃酮、反丁烯二酸和異嗪皮啶的含量。將表中數據進行橫向對比可看出，各部位的總黃酮含量葉﹥根﹥莖，反丁烯二酸含量莖﹥葉﹥根，而異嗪皮啶含量根﹥莖﹥葉。上述3種有效成分分別在葉、莖、根中含量最高，因此為達到最佳的藥用效果，腫節風的采收應以全草采收為宜，部分采收則容易造成某種成分的缺失。

3.2 不同采收期腫節風藥材的有效成分含量對比表1～3中分別列出了腫節風不同部位總黃酮、反丁烯二酸和異嗪皮啶的含量。將表中數據進行縱向對比可看出，腫節風各個部位有效成分的含量在不同的生長季節差異甚大：總黃酮的最高含量出現在8月葉中，反丁烯二酸最高含量出現在10月莖中，異嗪皮啶最高含量則出現在6月根中。各有效成分的含量最高點時間不同，因此在采收時需對此進行分析，選取3種成分含量均較高的時間進行采收。 根據“3.1”項下所述，腫節風藥用以全草為宜，若同時考慮總黃酮、反丁烯二酸和異嗪皮啶的含量，以6月、8月份腫節風中含量最高。其他生長季節內的腫節風藥材，雖然有某種單一有效成分含量較高的情況，但其他有效成分含量卻偏低。因此，腫節風藥材的最佳采收期為6月和8月。 本實驗以5～12月份腫節風藥材為材料，對不同生長季節的腫節風藥材不同部位3種有效成分（總黃酮、反丁烯二酸、異嗪皮啶）含量進行了測定。通過各不同生長期的有效成分含量對比可確定，6月、8月為腫節風藥材的最佳采收期，此時腫節風藥材的總黃酮、反丁烯二酸以及異嗪皮啶含量都很高；通過根、莖、葉3個部位的有效成分含量對比得出，腫節風根中異嗪皮啶含量最高，莖中反丁烯二酸含量最高，葉中總黃酮含量最高，各有效成分在不同部位的分布均不平衡，因此腫節風的采收應以全株采收為宜，這樣可保證采得的藥材中含有全部的有效成分，從而達到最佳的藥用效果。