作者：王磊磊，陳軍輝，王虹，殷月芬，王小如，楊東方

【摘要】 目的確定赤芍和白芍的高效毛細管電泳分析方法，建立赤芍和白芍的高效毛細管電泳法（HPCE）指紋圖譜。方法HPCE工作條件：采用未涂層熔融石英毛細管(內徑75 μm，有效長度50 cm) ，分離電壓為25 kV，柱溫25 ℃，二極管陣列檢測器(DAD)檢測波長為220 nm，緩沖液為30 mmol/L硼砂(pH = 9.0)溶液。按此條件對來自不同產地的7種赤芍樣品和8種白芍樣品進行了分析。結果建立了赤芍和白芍HPCE指紋圖譜，采用中藥指紋圖譜相似度計算軟件，以系統生成的對照指紋圖譜為對照模板對不同樣品的圖譜進行相似度計算。結論該方法簡捷、有效，可以用于赤芍和白芍藥材的質量控制。

【關鍵詞】 赤芍； 白芍； 高效毛細管電泳法； 指紋圖譜

Abstract：ObjectiveTo set up a modern High Performance Capillary Electrophoresis analysis method for separating and detecting Radix paeoniae Alba and Radix paeoniae Rubra and establish their fingerprints. MethodsSeven samples of Radix paeoniae Alba and eight samples of Radix paeoniae Rubra were carried out by HPCE under the following conditions: bared fused silica capillary (50 cm ×75 μm i.d. ) ， 30 mmol/L borate (pH = 9.0) as buffer， the run voltage is +25 kV， detection wavelength of UV at 220 nm， and column temperature of 25℃.ResultsThe fingerprints were confirmed and compared by the software of the similarity evaluation system for chromatographic fingerprint. ConclusionThe results showed that the method of HPCE fingerprint is reliable and accurate to control the quality of two Chinese traditional medicines.

Key words：Radix paeoniae Alba; Radix paeoniae Rubra; High Performance Capillary Electrophoresis ; Fingerprint

赤芍為毛茛科芍藥Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch. 直接使用的干燥根，其味苦，微寒，歸肝經，具有清熱涼血、散瘀止痛之功能。白芍為毛莨科芍藥Paeonia lacttiflora Pal1. 水煮去皮后使用的干燥根，其味苦、酸，微寒，歸肝、脾經，具有平肝止痛、養血調經、斂陰止汗之功能［1］。兩種藥材中均含有芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷等單萜苷類和苯甲酸、沒食子酸等酸類成分［2，3］，其中總苷類物質為藥材的主要活性成分［4］，因此2005版《中國藥典》規定芍藥苷的含量作為赤芍和白芍的質控指標。但是赤芍和白芍的療效和在臨床使用上有很大不同，僅使用單一成分作為指標進行質量控制，不能全面反映藥材的有效成分，難以真正全面地控制藥材的內在質量。中藥指紋圖譜是指中藥材經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材及其制劑的各組分群體特性的共有峰的圖譜［5］。色譜指紋圖譜是通過把復雜的化學成分進行分離，形成高低不同的峰，組成一張色譜圖，整個色譜圖表達了該樣品所含化學成分的多少和量的大小，不僅可用于已知成分的分析，還可以用于未知成分的分析［6］。因此指紋圖譜目前被國際上公認為是植物藥和中草藥質量控制最有效的工具之一 ［7］，如《美國草藥典》(AHP)為五味子、甘草等熱點植物藥確定了比較穩定可靠的TLC、HPLC分析結果和指紋圖譜，為該類藥材的生產和應用提供依據［8］。

近年來，將色譜指紋圖譜的方法用于赤芍和白芍研究的相關文獻也不斷出現，但這些文獻多利用高效液相色譜法（HPLC）進行研究［9～12］，如王巧等［10］利用HPLC分析了三十多種赤芍和白芍藥材的醇提物，建立了白芍與赤芍的HPLC指紋圖譜分析方法 。但用HPLC進行中藥成分分析，運行成本較高、分析時間長，而且常遇到一些問題，例如色譜柱易受污染，并且對于含極性成分較多的中藥，其“指紋”的特征性不強。相比而言，高效毛細管電泳法（HPCE）分析中藥則有獨特的優勢，具有柱效高、快速、進樣體積小，水溶性樣品的“指紋”特征性強，前處理簡單，而且分析運行成本低［13，14］的優點。關于赤芍或白芍HPCE指紋圖譜的研究未見報道，所以本文對赤芍和白芍藥材的HPCE指紋圖譜進行了探索性研究，以期為有效控制赤芍和白芍藥材質量提供新的方法。

1 儀器與試劑

G1062A 型HPCE儀(美國Agilent公司)，配有二極管陣列檢測器(DAD)；未涂層熔融石英毛細管(美國Agilent公司)，內徑75 μm，有效長度50 cm；KQ-400KDE型高功率數控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)；R201型旋轉蒸發儀(上海申生科技有限公司)；FA1104型電子天平(上海精天電子儀器廠)。

硼砂，無水乙醇，氫氧化鈉均為分析純，甲醇為色譜純，實驗用水均為Milli-Q超純水。芍藥苷標準品（110736-200629）購自中國藥品生物制品檢定所，其他樣品購自各藥品公司，來源為全國各產地。

2 方法與結果

2.1 標準溶液及供試品溶液的配制

2.1.1 標準溶液的配制準確稱量芍藥苷標準品，加入甲醇溶解定容，用30 mmol/L的硼砂溶液稀釋。進入HPCE系統前經0.45 μm微孔濾膜過濾。

2.1.2 供試品溶液的制備將供試樣品干燥后進行粉碎，過60目篩。準確稱取粉碎后的樣品1.0 g，置于100 ml具塞錐形瓶中，加入40 ml 95%乙醇，在35℃溫度條件下超聲輔助提取30 min，提取液過濾，將濾液在55℃條件下進行旋轉蒸發濃縮至干，再加入30 mmol/L硼砂溶液20 ml 溶解，過0.45 μm微孔濾膜后作為供試品溶液。

2.2 HPCE工作條件采用壓力進樣方式，壓力50 mbar，進樣時間3s，分離電壓25 kV，運行溫度保持25℃，紫外檢測波長220 nm，帶寬8 nm，參比波長500 nm，運行緩沖液為30 mmol/L的硼砂溶液(用氨水調pH值至9.0)。試樣進入毛細管前，均需過0.45 μm微孔濾膜，分析開始前，依次用1 mol/L NaOH溶液，超純水和緩沖液沖洗毛細管各5 min，分析過程中，及時更換緩沖液瓶中的緩沖溶液，以保證兩緩沖液瓶中緩沖液組分一致，保證分析精度。

2.3 提取方法優化

2.3.1 提取溶劑的選擇根據2005版《中國藥典》，對赤芍與白芍進行鑒別時，選用乙醇作為提取溶劑，對赤芍項下芍藥苷進行含量測定時，選用甲醇作為提取溶劑，而水煎提取是中草藥傳統提取方法，所以本研究對不同溶劑（水、甲醇、乙醇）作提取溶劑時所得到的圖譜進行了比較。測定結果表明，以水為提取溶劑時，出峰數量少且各峰響應值較低，不適于做指紋圖譜；甲醇為提取溶劑時，提取結果與乙醇類似，但是甲醇與乙醇相比，有較強的毒性，會對實驗人員及環境造成一定的危害；而用乙醇提取時，分離度較好，基線較平穩，適合做指紋圖譜，而且安全無害，因此選擇乙醇做提取溶劑。但是由于乙醇與緩沖鹽溶液極性不同，對各種化學成分的的溶解度也不相同，因此直接將乙醇提取液進樣檢測時，色譜峰會出現較嚴重的拖尾現象，而將乙醇蒸干，以緩沖溶液重新溶解提取物再進樣，可以解決這個問題，得到峰形較好的色譜圖。

繼續考察了50%，70%和95%3種不同濃度的乙醇作為提取溶劑得到的提取結果。結果表明，以50%乙醇為提取溶劑時，分離度較差，基線漂移嚴重，以70%乙醇為提取溶劑時，基線也略有漂移，而以95%乙醇為提取液時分離結果較為理想（見圖1～3）。

2.3.2 提取方法的選擇比較了回流法和超聲輔助提取法對樣品進行提取，結果顯示，回流法與超聲輔助提取法得到類似結果，但是回流法操作復雜，處理時間較長，且加熱過程可能會引起其它組分的變化，比較而言，超聲法方便快速，提取效率較高，且結果良好，因而選用超聲法進行提取。

2.4 HPCE實驗條件優化

2.4.1 緩沖溶液性質對分離結果的影響HPCE分離各種組分是利用電泳的原理，但由于電滲的存在，又與傳統的電泳不同，電滲就是毛細管中的溶劑因軸向直流電場作用而發生的定向流動，這種流動能夠實現所有樣品組分的同向泳動，實現正負離子的同時分離，而HPCE運行中的緩沖溶液可以直接影響或改變電滲［15］，因此緩沖溶液的性質會直接影響樣品分離結果。

根據文獻報道，出于對藥材中的成分進行質譜定性分析的期望，本實驗首先選擇可進行質譜分析的碳酸銨和乙酸銨水溶液作為緩沖溶液，但是結果表明碳酸銨水溶液和乙酸銨水溶液作緩沖液時，樣品響應值低，分離度不高，得到的HPCE譜圖不適于作指紋圖譜，而選擇紫外吸收比較低，pH緩沖范圍比較寬的硼砂水溶液作為緩沖液時，則取得了較好的分離結果，因此確定硼砂溶液作為分離赤芍和白芍樣品的緩沖體系，并對其濃度和pH值的選擇作了系統的考察。

首先比較了10，20，30和40 mmol/L 的硼砂溶液作緩沖液時得到的色譜圖（見圖4～7），由圖4～7可以看到，隨著濃度的升高，樣品中各峰的保留時間差別逐漸增大，分離效果也越好，但由于硼砂溶液有較高的電導率，濃度過高時，會導致產生熱量較多，不利于分離，而且保留時間過長，會延長每次進樣分析的周期，因此選擇30 mmol/L的硼砂溶液作為緩沖液，各峰得到較好的分離，且分析時間較短。

緩沖液的pH值控制弱電解質樣品的有效淌度、電滲甚至樣品在管壁上的吸附水平，因此對柱效和樣品的分離度有顯著的影響，本實驗比較了緩沖液pH值分別是4.1，6.4，7.2和9.0時得到的分離結果（見圖8～11），隨著緩沖液的pH值逐漸升高，保留時間變短，分離度顯著提高，峰形更好，所以本研究最終選擇pH9.0的硼砂溶液作為緩沖液。

緩沖液中加入少量的有機溶劑常常能有效改善分離度，并使許多水難溶的樣品得以用毛細管電泳分析，所以本實驗嘗試在硼砂水溶液中分別加入少量的甲醇和乙腈，但是結果只略影響響應值的大小，對分離度并無顯著影響，所以本研究只選用硼砂水溶液作緩沖液，不加任何有機添加劑。

2.4.2 HPCE電壓和溫度的選擇本實驗采用瞬間升壓的恒壓工作方式，對不同的工作電壓進行比較選擇。在15～30 kV的范圍內，隨著電壓的升高，分離效率升高，分離速度加快，但在較高的電壓下，焦耳熱效應過大，導致峰形較差，噪音明顯增大，不利于進行分析，所以選擇25 kV作為運行電壓，在此條件下電流穩定，且可以得到較好的分離結果。

電泳溫度的選擇主要指毛細管外表溫度的選擇與控制，應該考慮熱效應控制、重復性控制、分離效率控制和分離介質對溫度的限制等因素，同時受到儀器條件的影響。本實驗考察了溫度在15～30℃的范圍內得到的不同分離結果，溫度過低時，分離效率不高，分離速度過慢，而溫度過高時，熱效應過大，也會影響分離結果，所以最終選擇25℃作為電泳溫度。

2.4.3 檢測波長的選擇根據文獻報道，利用HPLC對赤芍或白芍樣品進行紫外檢測時，多選用230 nm作為檢測波長［16，17］，故本實驗首先選擇230 nm波長進行檢測，結果發現芍藥苷響應值較大，而其他成分響應值則相對較低，導致譜圖中出峰數量少，不適于作為表現所有成分整體情況的指紋圖譜。而通過分析一個樣品提取物的三維-紫外-毛細管電泳（3D-UV-CE）圖，比較不同波長下的紫外吸收值的大小，確定220 nm為檢測波長時，得到的譜圖較之其他檢測波長基線平穩，分離度較好，可以得到最佳的指紋圖譜，所以最后選擇220 nm作為檢測波長。

2.5 方法學考察

2.5.1 色譜峰的定位本文主要根據對照品的保留時間對樣品進行色譜峰定性。芍藥苷作為赤芍和白芍中的重要有效成分之一，在藥材中含量較高，而且藥典規定以它作為赤芍和白芍的質控指標，所以本實驗選擇芍藥苷標準品對樣品中的芍藥苷峰進行定性，并以此峰作為參照峰。實驗時以標準溶液和樣品供試溶液按相同的條件進樣分析，通過對比得到的兩份色譜圖，并將其UV譜圖與相應已知標準品圖譜進行比較印證，以確定與對照品相應的峰位，最終確認樣品譜圖中與標準品譜圖保留時間相同的峰為芍藥苷峰（見圖12）。

a-標準品b-供試樣品

圖12 在相同條件下芍藥苷標準品的HPCE色譜圖

和光譜圖與供試樣品的HPCE色譜圖

2.5.2 精密度實驗按優化后的HPCE工作條件，對一個赤芍樣品供試品溶液進行6次重復進樣分析，測得譜圖中芍藥苷峰的峰面積和保留時間，分別計算其標準偏差，得到峰面積和保留時間的RSD值分別是2.46% 和0.59% ，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性實驗精密稱取同一樣品5份，分別按“2.1”項下處理方法制成供試品溶液，然后按照“2.2”項下的HPCE工作條件進樣測定，測得芍藥苷峰面積和保留時間，并計算其標準偏差，峰面積和保留時間的RSD值分別為3.93% 和0.42% ，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩定性實驗將一個赤芍樣品的供試品溶液按照“2.2”項下HPCE工作條件，分別在0，4，6，14，20，24h 時進樣測定，將一個白芍樣品的供試品溶液按相同條件，分別在0，2，4，8，18，24 h時進樣測定，結果顯示供試品溶液中芍藥苷在24 h內峰面積和保留時間無明顯變化，赤芍樣品中峰面積和保留時間的RSD值分別為2.66% 和0.88% ，白芍樣品中峰面積和保留時間的RSD值分別為2.93% 和0.34% ，說明供試品溶液在24 h內化學性質穩定。

2.6 不同藥材樣品指紋圖譜的建立本文檢測了經“2.1”項下方法處理的7個赤芍樣品和8個白芍樣品按“2.2”項下 HPCE方法進樣分析得到的結果，每個樣品平行進樣兩次，得到色譜圖。遵循建立HPCE指紋圖譜的技術參數，建立赤芍和白芍樣品的指紋圖譜。

指紋圖譜中主要特征峰的相對保留時間或峰面積比值能較全面地反映所含成分的相對關系，體現中藥成分的復雜性和相關性，有利于更好地評價、控制中藥材及中藥產品質量［18］。本文選擇在所有赤芍和白芍樣品中均存在，且具有一定峰面積的芍藥苷峰作為參照峰，分別求出赤芍與白芍指紋圖譜中各特征峰的相對保留時間的平均值（α）及相對標準偏差（RSD%）和相對峰面積（結果見表1～2）。由所得的相對保留時間的數據可以判斷標定，赤芍樣品色譜指紋圖譜中共有10個共有峰，其峰面積總和占總峰面積的93%以上，其中3 號峰確認為芍藥苷（見圖13）；白芍樣品色譜指紋圖譜中共有15個共有峰，其峰面積總和占總峰面積的97%以上，其中2 號峰確認為芍藥苷（見圖14）。 表1 赤芍HPCE指紋圖譜中共有峰的相對保留時間和相對峰面積表2 白芍HPCE指紋圖譜中共有峰的相對保留時間和相對峰面積

2.7 指紋圖譜相似度分析指紋圖譜反映的是樣品整體的特征，進行指紋圖譜比較，可以反映樣品之間的親疏程度，但是單純的直觀比較指紋圖譜的峰的多少和峰的大小，帶有個人的主觀性。相似度可以定量的描述指紋圖譜，本實驗用相似度分析對樣品進行了比較，可以定量的、客觀的對樣品進行評價［9］。

相似度計算方法多有不同，有文獻采用Excel軟件，按相關系數原理進行處理［19］，但大多采用專門的相似度計算軟件處理。本研究采用國家藥典委員會推薦使用，由浙江大學制藥工程研究所計算機輔助中藥分析實驗室研發的“中藥指紋圖譜相似度計算軟件”［20］，以夾角余弦作為相似度的評價指標，對測定結果進行圖譜比對，評價供試樣品指紋圖譜與系統生成的對照指紋圖譜（各樣品譜圖峰面積的平均值）的相似性，對照共有圖說分別計算得到赤芍和白芍藥材提取物的相似度。結果見表3～4。表3 赤芍樣品提取物指紋圖譜相似性分析結果表4 白芍樣品提取物指紋圖譜相似性分析結果 由表3中的數據，可以看出各產地赤芍相似度一般。雖然由表1中的數據可以看出各赤芍樣品的譜圖中各峰出峰時間的相對標準偏差很小，但是峰面積相差較大，說明樣品中的化學成分種類相仿，而各成分的含量不同，推測可能是由于赤芍中的化學成分受各產地生長環境影響較大造成的。

同樣，由表4中的數據，可以看出除了6號和8號樣品，其他產地的白芍樣品相似度都較高。

由上可見，以芍藥苷作為唯一指標，不能全面的反映赤芍和白芍中所有成分的信息，難以真正控制藥材質量，指紋圖譜可以彌補這一缺陷，全面反映藥材的內在質量。而指紋圖譜的相似度分析，又為這種方法提供了定量分析的保證，從而對中藥產品質量作出較全面、準確的評價。

3 結論

雖然藥典中規定赤芍與白芍藥材都以芍藥苷的含量作為質控指標，但是兩種藥材療效及臨床應用相當不同，由本研究經過一系列條件優化最終建立的HPCE指紋圖譜，則可以看出兩者的指紋圖譜區別明顯，說明赤、白芍化學成分的種類與含量有明顯不同，這點與其他文獻得到的結果相符，推測由指紋圖譜所反映出的這些區別可能與其臨床療效的不同有相關性。本文所建立的赤、白芍HPCE檢測方法，前處理便易操作，分析速度快，具有良好的重現性、穩定性，得到的結果可用于兩者的質量分析與評價。