作者：方洪壯鄒純才 宗希明

【摘要】 運用遞歸漸進光譜投影法，探索中藥材東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮石油醚提取物的色譜指紋特征化學(xué)成分的異同。指紋特征數(shù)據(jù)由高效液相色譜法獲得，流動相為乙腈-1‰磷酸水溶液梯度洗脫，流速1.0 ml/min，柱溫20 ℃，光譜記錄范圍為200～400 nm。經(jīng)比較，東北鐵線蓮和棉團鐵線蓮的色譜指紋特征中，至少分別有8和6種單獨的化學(xué)成分存在，兩者的共有的化學(xué)成分有14種。

【關(guān)鍵詞】 遞歸漸進光譜投影法; 東北鐵線蓮; 棉團鐵線蓮; 指紋特征

借助化學(xué)計量學(xué)方法分析色譜光譜二維數(shù)據(jù)中化學(xué)成分的異同，是中藥指紋圖譜研究的重要內(nèi)容，已有光譜相關(guān)色譜、窗口目標檢驗因子分析、交替移動窗口因子分析等方法成功用于多種中藥化學(xué)成分比較分析［1～3］。毛莨科植物東北鐵線蓮（Clematis manshurica Rupr）和棉團鐵線蓮（Clematis hex-apetala Pall）的干燥根及根莖被收載在中國藥典一部中的威靈仙藥材項下［4］，近年來發(fā)現(xiàn)具有多種藥理作用［5］。中藥威靈仙的指紋圖譜研究，現(xiàn)僅涉及其揮發(fā)油部分［6］，揭示威靈仙內(nèi)在化學(xué)成分本質(zhì)的差異，對相關(guān)的藥學(xué)深入研究與臨床使用有重要的意義。遞歸漸進光譜投影是新近提出的一種化學(xué)計量學(xué)多元分辨方法，可用于二維色譜數(shù)據(jù)重疊峰濃度窗口的確認［7］。本研究將遞歸漸進光譜投影法用于不同色譜指紋特征的化學(xué)成分的異同的分析，比較東北鐵線蓮和棉團鐵線蓮石油醚提取物的指紋圖譜HPLC-DAD二維數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)東北鐵線蓮和棉團鐵線蓮石油醚提取部分中共有的化學(xué)成分有14種，兩者單獨的化學(xué)成分分別有8種和6種，東北鐵線蓮中較棉團鐵線蓮含有較多的齊墩果酸。實驗結(jié)果為進步確定兩種藥材石油醚提取物中的化學(xué)成分及相關(guān)的藥學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1方法原理

設(shè)A和B分別為經(jīng)色譜-光譜聯(lián)用采集的兩種中藥樣品的色譜指紋圖譜的數(shù)據(jù)矩陣，矩陣的大小均為M ×N 階，它們行的方向表征了色譜的流出信息（M個流出時間點），列的方向表征了光譜信息（N個吸收波長）。選擇A中某一指紋特征峰的測定數(shù)據(jù)矩陣片斷X，用漸近因子分析方法分別前向計算和反向計算獲得其秩圖［8］，根據(jù)秩圖給出的組分數(shù)m，在A中設(shè)定m個前向和反向信息區(qū)。從第一信息區(qū)，選取一列數(shù)據(jù)作為代表性光譜s1 ，按設(shè)定的窗口尺寸w，從樣品B中數(shù)據(jù)矩陣片斷Y自色譜起始時間取w行子矩陣Y1 ，計算投影殘差r1 1 : r1 1 =s1 T （I-Y1 Y1 + ）s1 （1）其中I為N階單位方陣，“T”表示矢量的轉(zhuǎn)置，“+”表示矩陣的廣義逆;移動1個色譜時間點窗口，計算投影殘差r'2 ;不斷移動窗口，運算至Y的色譜終點，得一系列投影殘差r11 ，r1 2 ，…，r1 i ，…，r1 n 。由第二信息區(qū)，選取代表性光譜s2 ，對Y計算一系列投影殘差r2 i =s2 T （I-Y2 Y2 + ）s2 。其中矩陣Y2 由樣品數(shù)據(jù)Y子矩陣Y1 和光譜s1 構(gòu)成:Y2 =［Y1 ， s1 ］（2）對每一信息區(qū)j，選取代表性光譜sj ，按Yj =［Y1 ， sj-1］計算一系列投影殘差rj i =sj T （I-Yj Yj + ）sj 。以得到的m個投影殘差矢量對n個保留時間作圖，判定兩樣品中化學(xué)成分的異同。當(dāng)在某一保留時間i處，樣品B中含有樣品A中的化學(xué)成分，rj i 的數(shù)值必將接近于零，反之，在該保留時間點樣品B中缺少樣品A中的化學(xué)成分。同理，以樣品B為基準進行因子分析，選取代表性光譜，對樣品A計算投影殘差，可判定A中有無B中的化學(xué)成分。

2實驗部分 2.1儀器與試劑 高效液相色譜儀:HP1100型，包括Agilent1100四元泵，HP1100二極管陣列檢測器，HP色譜化學(xué)工作站（美國安捷倫科技公司）。東北鐵線蓮、棉團鐵線蓮:2005年9月采自伊春市亮子河林區(qū)，按中國藥典2005版一部相關(guān)項下鑒別為藥典規(guī)定的相應(yīng)品種。齊墩果酸對照品（110709-200304）購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈、甲醇為色譜純;無水乙醇、鹽酸與石油醚（60～90℃）為分析純。

2.2樣品制備

2.2.1對照品溶液 取齊墩果酸對照品約10mg，精密稱定，置10ml容量瓶中，加甲醇適量使其溶解，加甲醇至刻度。制成1mg/ml 的齊墩果酸對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 東北鐵線蓮及棉團鐵線蓮的干燥根和根莖，經(jīng)粉碎后，分別過5號（180±7.6μm）藥篩。分別取藥材粉末1g，加乙醇50ml，加熱回流2h，濾過，濾液濃縮至約20ml，加鹽酸3ml，加熱回流1h，加水10ml，放冷，加石油醚振搖提取3次，石油醚用量分別為20ml、10ml、10ml，蒸干石油醚，殘渣用1ml甲醇溶解，經(jīng)0.45 μm油性微孔濾膜過濾，制成東北鐵線蓮及棉團鐵線蓮的供試品溶液。

2.2.3空白溶液 取乙醇50ml，同供試品溶液制備方法，加熱回流提取，石油醚殘渣加甲醇1ml溶解制得。

2.3指紋圖譜獲取

2.3.1色譜條件 色譜柱:Eclipse XDB-C18柱（250 mm× 4.0mm ID，5 μm），保護柱:Zorbax SB-C18柱（12.5mm× 4.6mm ID，5 μm）;流動相:乙腈（A）-1‰磷酸水溶液（B）作梯度洗脫，0min，25%A-75%B，保持5min;30min，85%A-15%B，保持10min;45min，100%A，保持15min。流速:1.0ml /min;柱溫:20 ℃;檢測波長與參比波長分別為210nm與400nm，相應(yīng)譜帶寬分別為4nm與50nm;進樣量為20μl。

2.3.2指紋圖譜 取齊墩果酸對照品溶液、空白溶液、東北鐵線蓮及棉團鐵線蓮供試液，分別按2.3.1項下的色譜條件進行檢測。根據(jù)齊墩果酸對照品色譜與空白溶液的色譜確定齊墩果酸與空白峰，見圖1a和圖1b。選取兩種鐵線蓮色譜中的齊墩果酸色譜峰為參照物峰，結(jié)合空白色譜峰，按國家藥品監(jiān)督管理局的中藥注射劑色譜指紋圖譜研究技術(shù)要求（暫行）規(guī)定的檢測方法與相關(guān)內(nèi)容制備指紋圖譜，結(jié)果分別見圖2a和2b。

2.4數(shù)據(jù)分析在色譜儀上間隔2 nm記錄采集東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮色譜光譜二維數(shù)據(jù)，并選取各色譜中與參照物峰峰面積比大于2%的色譜峰作為比較分析的目標峰。以棉團鐵線蓮作為被比較的樣品，按方法原理，從東北鐵線蓮的色譜光譜數(shù)據(jù)中的相應(yīng)信息區(qū)內(nèi)分別選取光譜，計算棉團鐵線蓮的數(shù)據(jù)投影殘差并繪圖，判定相同的化學(xué)成分是否存在以及在色譜指紋圖譜中的位置。將東北鐵線蓮作為被比較的樣品，比較計算、判定有無棉團鐵線蓮的化學(xué)成分，從而完成色譜指紋圖譜化學(xué)成分存在與否的判別。

s-齊墩果酸 1，2-空白色譜峰

圖1 齊墩果酸對照品 （a）和空白溶液（b）色譜圖（略）

圖2 東北鐵線蓮（a）與棉團鐵線蓮（b）的色譜指紋圖（略）

3結(jié)果與討論

表1 東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮的化學(xué)成分保留時間（略）

3.1兩種鐵線蓮的比較 交替比較計算分析東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮色譜-光譜數(shù)據(jù)，得到兩色譜指紋圖譜中各化學(xué)成分和峰位結(jié)果如表1。由表1可知，東北鐵線蓮及棉團鐵線蓮分別有22及20個化學(xué)成分，至少有8個化學(xué)成分存在于東北鐵線蓮中，而在棉團鐵線蓮色譜指紋圖譜中未發(fā)現(xiàn)，棉團鐵線蓮至少有6個化學(xué)成分在東北鐵線蓮中未發(fā)現(xiàn)。色譜指紋圖中東北鐵線蓮43.61 min與棉團鐵線蓮43.22 min處的色譜峰為齊墩果酸色譜峰。與棉團鐵線蓮比較，齊墩果酸在東北鐵線蓮中的含量較高。

3.2空白溶液色譜峰空白溶液的色譜圖1b顯示，空白溶液在35.20min與 52.30min 處有兩個不可忽略的色譜峰。另由圖2可知，東北鐵線蓮及棉團鐵線蓮的色譜在相對應(yīng)的保留時間處，均有一定強度的色譜峰。兩種鐵線蓮色譜光譜所涉及的空白色譜峰處數(shù)據(jù)秩圖表明，第1與第2個色譜峰的成分數(shù)分別為1和2。分別用空白溶液峰1和峰2的光譜，對兩種鐵線蓮涉及的色譜峰處的數(shù)據(jù)作窗口移動正交投影、計算投影殘差，結(jié)果得到東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮在保留時間35.18min及 52.24min 處色譜峰的光譜，與空白溶液色譜峰的光譜相同，可斷定為是由樣品制備的溶劑而引入，而在保留時間東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮52.32、52.54min處重疊色譜峰中有空白溶劑峰2。

3.3化學(xué)成分的比較實驗結(jié)果表明，遞歸漸進光譜投影不僅可用于二維色譜數(shù)據(jù)重疊峰濃度窗口的確認，而且可用于不同色譜指紋特征的化學(xué)成分異同的比較分析。東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮含有較多的相同化學(xué)成分，這些成分與威靈仙藥理作用的聯(lián)系，需要深入的相關(guān)藥學(xué)研究加以證實。另外，由于實驗中色譜特征的光譜數(shù)據(jù)為紫外光譜，僅能在一定的程度上判定不同色 譜指紋特征的化學(xué)成分的異同，無法確定化學(xué)成分歸屬。遞歸漸進光譜投影法及本實驗的色譜條件可供液-質(zhì)的二維數(shù)據(jù)的獲取，以便分析確認色譜指紋特征的化學(xué)結(jié)構(gòu)。東北鐵線蓮與棉團鐵線蓮色譜指紋特征可用于相關(guān)藥材的質(zhì)量控制。