作者：劉愛東， 侯微， 陳雪松， 邱智東

【摘要】 目的：采用CO2超臨界流體萃取法提取前胡藥材中的白花前胡甲素。 方法：采用正交實驗設計法優選前胡中白花前胡甲素的最佳萃取條件，并與傳統提取方法作比較。 結果：以白花前胡甲素的提取量為指標，最佳萃取條件為萃取溫度60 ℃、萃取壓力20 MPa、萃取時間3 h。加入夾帶劑乙醇后白花前胡甲素提取量增加，且超臨界流體萃取法明顯高于水煎煮和加熱回流法。 結論：CO2超臨界流體萃取法提取前胡藥材中白花前胡甲素的方法可行、可靠。

【關鍵詞】 CO2超臨界流體萃取; 前胡; 白花前胡甲素

Methods: After preliminary experiment， three main factors were acquired that could influence the result of SFECO2， including the time， pressure and temperature of the extraction. The optimal extraction process was carried out on orthogonal design， and SFECO2 was compared with the traditional methods.

Results: In the extraction of the praeruptorin A， the best extraction conditions were 60 ℃， 20 MPa， and duration for three hours. As cosolvent alcohol was added， the amount of extraction of the praeruptorin A increased， and the amount of SFECO2 extraction was higher than those of decoction and heating reflux.

Conclusion: The SFECO2 in extracting praeruptorin A from Radix Peucedani is feasible and reliable.

Keywords: chromatography， supercritical fluid; Peucedanum decursivum; praeruptorin A

前胡為傘形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dumn的干燥根，具有散風清熱、降氣化痰等功效。前胡中含有以白花前胡甲素為主的香豆素類成分，一般采用水煎煮及乙醇加熱回流法提取。本研究采用CO2超臨界流體萃取法(supercritical fluid extraction， SFE)提取前胡中的白花前胡甲素，運用高效液相法測定白花前胡甲素的提取量，為前胡的提取研究提供一個新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 白花前胡甲素對照品購于中國藥品生物檢定所（供含量測定用），前胡藥材購于吉林宏檢藥材公司，經長春中醫藥大學鑒定室姜大成教授鑒定為傘形科植物白花前胡的干燥根。乙醇、CO2氣體和其他試劑均為色譜純。HA2215060型超臨界流體萃取裝置，購于江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；日本島津高效液相色譜儀，購自日本Shimadzu公司；Diamonsil TMC18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），購自迪馬公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CO2超臨界流體萃取條件的優選 CO2超臨界流體萃取條件的選取參照文獻方法［1～4］，經預實驗，發現3個主要影響因素，包括萃取溫度（A）、壓力（B）和時間（C）。見表1。

表1 CO2超臨界流體萃取實驗的因素和水平（略）

Table 1 Factors and levels in SFECO2 method

1.2.2 CO2超臨界流體萃取方法 取前胡藥材，粉碎，過10～20目篩，稱取100 g，置于1 L萃取釜內進行提取。得到的提取物用乙醇作為吸收劑，定容于50 ml量瓶中，混勻，靜置24 h，用高效液相測定白花前胡甲素含量。確定工藝條件后，重復實驗3次，以驗證實驗結果是否穩定。

1.2.3 驗證實驗 按上述確定的工藝條件，即萃取溫度60 ℃，萃取壓力20 MPa，萃取時間3 h，重復實驗3次，每次取100 g藥材，通過高效液相測其含量。

1.2.4 與加夾帶劑的比較 CO2超臨界流體萃取技術的研究結果最終將應用到藥物的生產上，而其他有機試劑對人類的健康是有害的，因此首選乙醇作為夾帶劑［5， 6］。以80%乙醇和90%乙醇為夾帶劑進行超臨界萃取，并與加入夾帶劑前的白花前胡甲素含量進行對比（以100 g生藥含白花前胡甲素計）。

1.2.5 與傳統方法提取前胡藥材中白花前胡甲素的比較

1.2.5.1 水煎煮法提取 取100 g前胡藥材采用水煎煮法進行提取，加8倍于藥材量的水，煎煮3次，每次1 h，濾液濃縮，通過高效液相測定白花前胡甲素含量。

1.2.5.2 乙醇加熱回流法提取 取100 g前胡藥材采用乙醇加熱回流法進行提取，加8倍于藥材量的90%乙醇，提取3次，每次1 h，提取液回收乙醇，測定白花前胡甲素含量（以100 g生藥含白花前胡甲素計）。

1.2.6 白花前胡甲素的含量測定 參照文獻［7， 8］測定白花前胡甲素的含量。

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱，迪馬公司Diamonsil TMC18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相，甲醇水（75∶25）；檢測波長為321 nm；流速為0.8 ml/min；柱溫為30 ℃。理論塔板數按白花前胡甲素計算應不低于3 000。

1.2.6.2 對照品溶液的制備 取白花前胡甲素對照品適量，精密稱定，置量瓶中，加甲醇制成每1 ml含20 μg的溶液。

1.2.6.3 樣品溶液的制備 吸取提取物乙醇溶液10 ml，離心，棄去沉淀，精密吸取離心之后的上清液1.0 ml，置中性氧化鋁柱上（內徑為1 cm，裝有8.0 g中性氧化鋁），用40 ml乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶于5 ml量瓶中定容，過微孔濾膜（0.45 μm）。

1.2.6.4 白花前胡甲素含量測定法 精密吸取對照品溶液與樣品溶液各5 μl，注入液相色譜儀，測定。

1.2.6.5 線性關系考察 精密吸取白花前胡甲素對照品溶液3、5、7、10和15 μl注入液相色譜儀，以進樣量（μl）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6.6 穩定性實驗 精密吸取同一樣品溶液5 μl，分別在0、2、4、8、16和24 h測定一次，以白花前胡甲素峰面積積分值為指標，測定其穩定性。

1.2.6.7 精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液5 μl，分別注入液相色譜儀，連續進樣5次，依法測定，記錄峰面積積分值。

1.2.6.8 重現性實驗 精密吸取同一批樣品共5份，按供試品溶液項下方法制備，依法獨立測定，測定樣品含量，以考察本法的重現性。

1.2.6.9 回收率實驗 精密吸取同法測定的已知含量樣品（0.16 mg/ml）共5份，分別精密加入對照品一定量，依法測定，計算回收率。

1.3 統計學方法 采用DAS 2.0統計軟件進行統計分析，計量資料數據用x±s表示，采用方差分析進行組間比較并采用回歸模型進行相關性分析。

2 結果

2.1 CO2超臨界流體對白花前胡甲素萃取條件的優選 分別將每個因素設定3個水平，CO2超臨界流體萃取實驗按照正交實驗中3個水平L9（34）表進行設計，測定提取量。從方差分析可知，因素A和因素C的水平間有顯著差異。由表2可見，最佳的提取條件為A3B1C3，即萃取溫度60 ℃，萃取壓力20 MPa，萃取時間3 h，提取的白花前胡甲素的含量最高。見表2和表3。

表2 正交試驗結果（略）

Table 2 Result of orthogonal experiment

表3 方差分析結果（略）

Table 3 Result of analysis of variance

SS: Sum of squares of piation from mean.

2.2 驗證實驗 按上述確定的工藝條件，即萃取溫度60 ℃，萃取壓力20 MPa，萃取時間3 h，重復實驗3次，每次取100 g藥材，通過高效液相測其含量，結果白花前胡甲素的含量為每100 g含22.58 mg，21.05 mg，22.89 mg，表明萃取工藝穩定。

2.3 加入夾帶劑對白花前胡甲素提取量的比較 100 g前胡以90%乙醇為夾帶劑，提取物中白花前胡甲素含量為（31.05±2.58）mg，80%乙醇為夾帶劑時提取物中白花前胡甲素含量為（27.22±2.29）mg，高于不加夾帶劑的提取物中白花前胡甲素含量［（22.17±1.86）mg］（P<0.05），且以90%乙醇為夾帶劑時提取物中的白花前胡甲素含量高于80%乙醇（P<0.05）。

2.4 與傳統方法提取前胡藥材中白花前胡甲素的比較 100 g前胡水煎煮法提取得到的白花前胡甲素的提取量為（5.06±0.49）mg，明顯低于超臨界萃取得到的含量［（22.17±1.86）mg］（P<0.05）。乙醇加熱回流法提取得到的白花前胡甲素提取量為（10.58±1.06）mg，低于超臨界萃取得到的提取量（P<0.05）。

2.5 白花前胡甲素含量測定方法學考察結果

2.5.1 線性關系考察 得到白花前胡甲素的回歸方程為：y＝24 602 x－5 502、r＝0.999 9，由此確定白花前胡甲素線性范圍為0.047 4～0.237 0 mg。

2.5.2 穩定性實驗 在0～24 h內樣品中白花前胡甲素的測定結果相對標準偏差為1.7%，說明在此時間范圍內供試品溶液具有良好的穩定性。

2.5.3 精密度實驗 白花前胡甲素對照品峰面積相對標準偏差為0.5%，儀器的精密度良好。

2.5.4 重現性實驗 本法測定白花前胡甲素含量相對標準偏差為0.5%，重現性良好。

2.5.5 回收率實驗 白花前胡甲素平均回收率為102.6%，回收率相對標準偏差為1.0%。

3 討論 前胡具有散風清熱、降氣化痰等功效，入藥部位為根，其主要有效成分是白花前胡甲素。經過CO2超臨界流體萃取研究，最佳實驗條件為萃取溫度60 ℃、萃取壓力20 MPa和萃取時間3 h。加入夾帶劑后，白花前胡甲素提取量增加。與傳統的提取方法比較，水煎煮法提取得到的白花前胡甲素的提取量明顯低于超臨界萃取得到的含量。乙醇加熱回流法提取得到的白花前胡甲素提取量低于超臨界萃取得到的提取量，約是超臨界萃取量的1/2，雖然高于水煎煮法得到提取量，但這種方法同樣存在著生產成本高，生產周期長的問題，而CO2超臨界流體萃取能夠克服傳統提取方法的缺點，具有很高的研究價值。 本實驗希望通過研究CO2超臨界流體萃取白花前胡甲素，找到CO2超臨界流體萃取香豆素類成分的共性，為CO2超臨界流體萃取法及香豆素類成分的提取提供科學的依據。 試驗過程結束后一般將提取后的藥粉基本棄去，浪費嚴重，不利于環保。因此，如何利用CO2超臨界流體萃取后的原料也是值得我們思考的問題。