作者：帕麗達·阿不力孜，王曉文，熱娜·卡斯木‘

【摘要】 目的對幾種天然藥物進行植物雌激素的活性篩選。方法采用人乳腺癌細胞增殖法與酵母菌雌激素篩檢實驗法對9種天然藥物進行了植物雌激素活性的研究。結(jié)果成功地建立了E-SCREEN法與Yeast Estrogen Screen實驗法，此兩種方法均可檢測到1×10-13 mol/L的雌二醇。MCF-7細胞增殖實驗結(jié)果表明，鷹嘴豆、新疆石榴皮、羅勒、枸杞水提取物可促使ER（＋）MCF-7細胞的增殖（P＜0.05），提示它們具有植物雌激素樣活性；酵母雙雜交（Yeast two-hybrid）系統(tǒng)實驗結(jié)果表明，鷹嘴豆、石榴皮水提取物均能使酵母系統(tǒng)中的β-半乳糖苷酶的活性增強（P＜0.05），提示它們具有植物雌激素樣活性。結(jié)論E-SCREEN法敏感性高，并有快速、簡便等優(yōu)點，適用于大量化合物的初選。

【關(guān)鍵詞】 人乳腺癌細胞增殖法； 酵母菌雌激素篩檢實驗； 雌激素活性

長期以來，許多中草藥植物被廣泛應(yīng)用于婦科病的治療和保健［1］，中藥所含植物雌激素成分在其中發(fā)揮的藥效作用不容忽視。因與雌激素化學結(jié)構(gòu)相似［2］，植物雌激素是植物中可以與哺乳類動物及人類的雌激素受體(Estrogen Receptor， ER)相結(jié)合并將其激活的一類化合物，被證實存在于包括中草藥在內(nèi)的多種植物中，而且在體內(nèi)具有雙向調(diào)節(jié)作用，即一方面在體內(nèi)雌激素水平較低時，可與ER結(jié)合發(fā)揮雌激素樣作用；另一方面，在體內(nèi)雌激素水平較高時，植物雌激素可通過競爭性結(jié)合靶細胞ER而產(chǎn)生抗雌激素樣作用，即減弱靶細胞對雌激素的應(yīng)答。因此，近年來植物雌激素又被稱為“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”(selective estrogen receptormod-ulators， SERMs)或中藥選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。對中藥植物雌激素活性篩選、活性成分及其作用機制、特別是關(guān)于這些成分對雌激素依賴性腫瘤細胞增殖的影響的研究尚不夠深入。本研究在上報的茯苓等中藥雌激素活性篩選的基礎(chǔ)上，選擇課題組正在研究的富含黃酮類、香豆素類、木脂素類及二苯乙烯類成分的新疆石榴皮、紅景天、羅勒、阿里紅、枸杞、肉蓯蓉、鎖陽、鷹嘴豆、新疆鼠尾草等9種天然藥物，對其植物雌激素活性進行了初步的篩選。

1 材料與儀器

1.1 藥物新疆石榴皮Punica granatum L. （購自新疆南疆）；羅勒Ocimun basilicum L. （采自新疆吐魯番市）；紅景天Rhodiola rose L.（購自新疆伊寧霍誠縣）；阿里紅Fomes officinalis Ames.（購自新疆維吾爾醫(yī)院）；鷹嘴豆Cicer arietinum L.（購自新疆維吾爾醫(yī)院）；枸杞Lycium barbarum L. （購自新疆中新藥業(yè)公司）；肉蓯蓉Cistanche salsa.（采自新疆吉木薩鹽生肉蓯蓉人工栽培基地）；鎖陽Cynomorium songaricum Rupr.（購自新疆烏魯木齊市）；鼠尾草Salvia deserta Schang.（采自烏魯木齊市近郊）。各藥材分別用10倍量水煮提2次，過濾，合并濾液并減壓濃縮，真空干燥后配制成1 mg/ml的水提液。

1.2 試劑EMDM培養(yǎng)基、無酚紅EMDM培養(yǎng)基、17β-雌二醇、β-半乳糖苷酶、S.cerevisiac酵母菌株、SD培養(yǎng)基、Zymolase試劑（為Sigma公司產(chǎn)品），鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，日本和漢藥研究所提供），胎牛血清（FBS，日本和漢藥研究所提供），其余試劑均為日本產(chǎn)分析純。

1.3 儀器電子讀數(shù)分析天平(日本 Shimaduz 公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus)；臺式高速低溫離心機(美國Becton Dickinson公司)；全溫振蕩培養(yǎng)基(美國Becton Dickinson公司)；BIO-RAD Model 3550-UV紫外分光光度儀(日本SANYO公司)；25 mm2培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板（美國Becton Dickinson）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細胞株及培養(yǎng)條件

雌激素敏感的MCF-7人乳腺癌細胞由日本和漢藥研究所提供。以含5%胎牛血清（Hyclone）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2，相對濕度95%。

2.2 細胞增殖實驗

按E-screen法［3］并稍作修改，普通培養(yǎng)的MCF-7細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后以104個細胞/ml接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，貼壁24h后去除原培養(yǎng)基，換成實驗用培養(yǎng)基：無酚紅的DMEM基加10%熱滅活的無雌激素人血清，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，此時加入陽性（雌二醇）對照組設(shè)10-13～10-9mol/L 5個濃度，不同濃度的受試物和陰性（溶劑）對照組，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。6d后棄上清液，每孔加5mg/ml的四唑鹽（MTT）30 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去孔中的培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的DMSO，在540 nm波長測定吸光度并計算增殖率。結(jié)果見表1。 陽性對照(雌二醇)從濃度10-13～10-9 mol/L對MCF-7人乳腺癌細胞增殖力與對照組相比均有顯著性，并在10-10mol/L組實驗對MCF-7細胞增殖力最強，與其它各組相比差異有顯著性。說明本次實驗結(jié)果是可靠的。在此實驗條件下，高劑量組鷹嘴豆（P＜0.05）、石榴皮（P＜0.01）、羅勒（P＜0.05）、枸杞（P＜0.05）水提液與正常對照組均有顯著性差異；在低劑量組鷹嘴豆（P＜0.01）、石榴皮（P＜0.01）、羅勒（P＜0.01）水提液與正常對照組相比有統(tǒng)計學意義；而鼠尾草、肉蓯蓉、鎖陽、阿里紅、紅景天水提液與正常對照組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.3 酵母菌株和培養(yǎng)基的建立

過夜培養(yǎng)的酵母轉(zhuǎn)種至新的SD液體培養(yǎng)基中，加入不同濃度的植物提取物，于30℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)4 h，然后在595 nm測定吸光度。

2.4 β-半乳糖苷酶活性的測定

測定并記錄培養(yǎng)液的OD595，離心，棄取上清液，加入Zymolase 溶液，置37℃水浴中培養(yǎng)15 min，再加入ONPG溶液，置30℃水浴中培養(yǎng)30 min，加入1 mol/L Na2CO3100 μl終止反應(yīng)。在450 nm，540 nm波長測定吸光度，并計算β-半乳糖苷酶活性（U）值。結(jié)果見表1。表1 MCF-7細胞增殖實驗與酵母菌篩檢實驗結(jié)果（略）

（U）值=1 000×（A450－1.75×A540）/(ONPG反應(yīng)時間t×0.05×A595) 溶劑對照組的β-半乳糖苷酶活性為48.5，陽性對照組的酶活性為440.5，與溶劑對照組有顯著差異（P＜0.05），說明本實驗系統(tǒng)可靠，可用于對含有雌激素的樣品進行雌激素活性的測試。在此實驗條件下，鷹嘴豆（P＜0.05）、石榴皮（P＜0.05）水提液在高、低劑量組均與溶劑對照均有統(tǒng)計學差異；而枸杞、鼠尾草、肉蓯蓉、羅勒、鎖陽、阿里紅、紅景天水提液與溶劑對照組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均為3個重復(fù)的平均值，并表示為±s。利用Dunnett′s 進行統(tǒng)計學處理。

3 討論

近年來，在圍絕經(jīng)期綜合征等婦科病的治療中，雌激素替代療法因副作用明顯［4］，人們將更多的關(guān)注投向了植物雌激素以及含有植物雌激素成分的中草藥及其復(fù)方。以此為切入點，采用目前較常用的篩選雌激素方法——人乳腺癌細胞MCF-7細胞增殖實驗，從影響ER陽性MCF-7細胞增殖的角度進行了研究，結(jié)果顯示：石榴皮、羅勒、鷹嘴豆、枸杞水提物均能使ER陽性MCF-7細胞增殖，提示它們具有擬植物雌激素樣活性，因中藥植物雌激素與雌二醇結(jié)構(gòu)的相似性，可能與雌激素受體相結(jié)合而發(fā)揮一定的雌激素效應(yīng)。該作用與這些中藥所含的木脂素、香豆素、黃酮類成分有關(guān)。

酵母雙雜交技術(shù)是Fields等于1989年提出，是在重組基因酵母法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的環(huán)境雌激素物質(zhì)的檢測方法［5］，是基于核激素受體和輔激活蛋白之間的配體依賴作用而建立起來的實驗系統(tǒng)。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，雌激素受體（ERs）與酵母轉(zhuǎn)錄子GAL4的DNA結(jié)合域（DNA-BD）結(jié)合，輔激活蛋白與DNA轉(zhuǎn)錄激活域（DNA-AD）結(jié)合，構(gòu)建質(zhì)粒。由于ER與輔激活蛋白相互作用BD與AD在空間上接近，從而激活GAL4的激活序列（UAS）下游啟動子調(diào)節(jié)的lac-Z報告基因表達，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。因此β-半乳糖苷酶的活性大小就和ERs與輔激活蛋白之間的相互作用強度大小一致。但只有在雌激素物質(zhì)存在的情況下，ERs才能和輔激活蛋白結(jié)合，引起B(yǎng)D和AD在空間上接近，從而激活lac-Z報告基因表達，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。根據(jù)這一原理，通過測定β-半乳糖苷酶的活性即可反映受試物的雌激素樣作用。 近些年來，酵母雙雜交法應(yīng)用范圍得到了較大擴展，不僅應(yīng)用于檢測那些用于發(fā)展新牙科聚合物的化學物質(zhì)的雌激素活性［6］，也同時應(yīng)用于檢測和評價羥基化多氯聯(lián)苯的雌激素和甲狀腺激素活性［7］，以及評價多種化合物的抗雌激素活性［8］和天然藥物的雌激素活性的篩選研究［9］。本實驗結(jié)果顯示：鷹嘴豆、石榴皮水提液均能使酵母系統(tǒng)中β-半乳糖苷酶活性增加，表現(xiàn)出具雌激素樣作用。 有機體是一個復(fù)雜的體系，體外實驗結(jié)果仍需整體動物實驗加以驗證。因此，應(yīng)當注意在選擇進行體外實驗的同時，為了避免實驗結(jié)果的假陽性和假陰性，再進一步進行傳統(tǒng)的體內(nèi)實驗，以保證獲得更加準確的結(jié)論。 本研究用經(jīng)典的E-screen和Yeast Two-Hybrid Assay實驗，篩選了9種受試物的雌激素活性。以人乳腺癌MCF-7細胞增殖實驗結(jié)果評價，石榴皮、鷹嘴豆、羅勒、枸杞均具有雌激素樣活性；以酵母雙雜交實驗結(jié)果評價，石榴皮、鷹嘴豆有雌激素樣活性。鼠尾草、肉蓯蓉、鎖陽、阿里紅、紅景天在兩種體外實驗篩選中均無顯示出雌激素樣活性，至于它們是否具有雌激素樣作用還需從其它途徑進行研究。