作者：帕麗達(dá)·阿不力孜，王曉文，熱娜·卡斯木‘

【摘要】 目的對(duì)幾種天然藥物進(jìn)行植物雌激素的活性篩選。方法采用人乳腺癌細(xì)胞增殖法與酵母菌雌激素篩檢實(shí)驗(yàn)法對(duì)9種天然藥物進(jìn)行了植物雌激素活性的研究。結(jié)果成功地建立了E-SCREEN法與Yeast Estrogen Screen實(shí)驗(yàn)法，此兩種方法均可檢測(cè)到1×10-13 mol/L的雌二醇。MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鷹嘴豆、新疆石榴皮、羅勒、枸杞水提取物可促使ER（＋）MCF-7細(xì)胞的增殖（P＜0.05），提示它們具有植物雌激素樣活性；酵母雙雜交（Yeast two-hybrid）系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鷹嘴豆、石榴皮水提取物均能使酵母系統(tǒng)中的β-半乳糖苷酶的活性增強(qiáng)（P＜0.05），提示它們具有植物雌激素樣活性。結(jié)論E-SCREEN法敏感性高，并有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于大量化合物的初選。

【關(guān)鍵詞】 人乳腺癌細(xì)胞增殖法； 酵母菌雌激素篩檢實(shí)驗(yàn)； 雌激素活性

長(zhǎng)期以來(lái)，許多中草藥植物被廣泛應(yīng)用于婦科病的治療和保健［1］，中藥所含植物雌激素成分在其中發(fā)揮的藥效作用不容忽視。因與雌激素化學(xué)結(jié)構(gòu)相似［2］，植物雌激素是植物中可以與哺乳類動(dòng)物及人類的雌激素受體(Estrogen Receptor， ER)相結(jié)合并將其激活的一類化合物，被證實(shí)存在于包括中草藥在內(nèi)的多種植物中，而且在體內(nèi)具有雙向調(diào)節(jié)作用，即一方面在體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)，可與ER結(jié)合發(fā)揮雌激素樣作用；另一方面，在體內(nèi)雌激素水平較高時(shí)，植物雌激素可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合靶細(xì)胞ER而產(chǎn)生抗雌激素樣作用，即減弱靶細(xì)胞對(duì)雌激素的應(yīng)答。因此，近年來(lái)植物雌激素又被稱為“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”(selective estrogen receptormod-ulators， SERMs)或中藥選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。對(duì)中藥植物雌激素活性篩選、活性成分及其作用機(jī)制、特別是關(guān)于這些成分對(duì)雌激素依賴性腫瘤細(xì)胞增殖的影響的研究尚不夠深入。本研究在上報(bào)的茯苓等中藥雌激素活性篩選的基礎(chǔ)上，選擇課題組正在研究的富含黃酮類、香豆素類、木脂素類及二苯乙烯類成分的新疆石榴皮、紅景天、羅勒、阿里紅、枸杞、肉蓯蓉、鎖陽(yáng)、鷹嘴豆、新疆鼠尾草等9種天然藥物，對(duì)其植物雌激素活性進(jìn)行了初步的篩選。

1 材料與儀器

1.1 藥物新疆石榴皮Punica granatum L. （購(gòu)自新疆南疆）；羅勒Ocimun basilicum L. （采自新疆吐魯番市）；紅景天Rhodiola rose L.（購(gòu)自新疆伊寧霍誠(chéng)縣）；阿里紅Fomes officinalis Ames.（購(gòu)自新疆維吾爾醫(yī)院）；鷹嘴豆Cicer arietinum L.（購(gòu)自新疆維吾爾醫(yī)院）；枸杞Lycium barbarum L. （購(gòu)自新疆中新藥業(yè)公司）；肉蓯蓉Cistanche salsa.（采自新疆吉木薩鹽生肉蓯蓉人工栽培基地）；鎖陽(yáng)Cynomorium songaricum Rupr.（購(gòu)自新疆烏魯木齊市）；鼠尾草Salvia deserta Schang.（采自烏魯木齊市近郊）。各藥材分別用10倍量水煮提2次，過(guò)濾，合并濾液并減壓濃縮，真空干燥后配制成1 mg/ml的水提液。

1.2 試劑EMDM培養(yǎng)基、無(wú)酚紅EMDM培養(yǎng)基、17β-雌二醇、β-半乳糖苷酶、S.cerevisiac酵母菌株、SD培養(yǎng)基、Zymolase試劑（為Sigma公司產(chǎn)品），鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，日本和漢藥研究所提供），胎牛血清（FBS，日本和漢藥研究所提供），其余試劑均為日本產(chǎn)分析純。

1.3 儀器電子讀數(shù)分析天平(日本 Shimaduz 公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus)；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Becton Dickinson公司)；全溫振蕩培養(yǎng)基(美國(guó)Becton Dickinson公司)；BIO-RAD Model 3550-UV紫外分光光度儀(日本SANYO公司)；25 mm2培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板（美國(guó)Becton Dickinson）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件

雌激素敏感的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞由日本和漢藥研究所提供。以含5%胎牛血清（Hyclone）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2，相對(duì)濕度95%。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

按E-screen法［3］并稍作修改，普通培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后以104個(gè)細(xì)胞/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，貼壁24h后去除原培養(yǎng)基，換成實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基：無(wú)酚紅的DMEM基加10%熱滅活的無(wú)雌激素人血清，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，此時(shí)加入陽(yáng)性（雌二醇）對(duì)照組設(shè)10-13～10-9mol/L 5個(gè)濃度，不同濃度的受試物和陰性（溶劑）對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。6d后棄上清液，每孔加5mg/ml的四唑鹽（MTT）30 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去孔中的培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的DMSO，在540 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度并計(jì)算增殖率。結(jié)果見表1。 陽(yáng)性對(duì)照(雌二醇)從濃度10-13～10-9 mol/L對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞增殖力與對(duì)照組相比均有顯著性，并在10-10mol/L組實(shí)驗(yàn)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖力最強(qiáng)，與其它各組相比差異有顯著性。說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。在此實(shí)驗(yàn)條件下，高劑量組鷹嘴豆（P＜0.05）、石榴皮（P＜0.01）、羅勒（P＜0.05）、枸杞（P＜0.05）水提液與正常對(duì)照組均有顯著性差異；在低劑量組鷹嘴豆（P＜0.01）、石榴皮（P＜0.01）、羅勒（P＜0.01）水提液與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而鼠尾草、肉蓯蓉、鎖陽(yáng)、阿里紅、紅景天水提液與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 酵母菌株和培養(yǎng)基的建立

過(guò)夜培養(yǎng)的酵母轉(zhuǎn)種至新的SD液體培養(yǎng)基中，加入不同濃度的植物提取物，于30℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)4 h，然后在595 nm測(cè)定吸光度。

2.4 β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定

測(cè)定并記錄培養(yǎng)液的OD595，離心，棄取上清液，加入Zymolase 溶液，置37℃水浴中培養(yǎng)15 min，再加入ONPG溶液，置30℃水浴中培養(yǎng)30 min，加入1 mol/L Na2CO3100 μl終止反應(yīng)。在450 nm，540 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，并計(jì)算β-半乳糖苷酶活性（U）值。結(jié)果見表1。表1 MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)與酵母菌篩檢實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）

（U）值=1 000×（A450－1.75×A540）/(ONPG反應(yīng)時(shí)間t×0.05×A595) 溶劑對(duì)照組的β-半乳糖苷酶活性為48.5，陽(yáng)性對(duì)照組的酶活性為440.5，與溶劑對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可靠，可用于對(duì)含有雌激素的樣品進(jìn)行雌激素活性的測(cè)試。在此實(shí)驗(yàn)條件下，鷹嘴豆（P＜0.05）、石榴皮（P＜0.05）水提液在高、低劑量組均與溶劑對(duì)照均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而枸杞、鼠尾草、肉蓯蓉、羅勒、鎖陽(yáng)、阿里紅、紅景天水提液與溶劑對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)重復(fù)的平均值，并表示為±s。利用Dunnett′s 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

3 討論

近年來(lái)，在圍絕經(jīng)期綜合征等婦科病的治療中，雌激素替代療法因副作用明顯［4］，人們將更多的關(guān)注投向了植物雌激素以及含有植物雌激素成分的中草藥及其復(fù)方。以此為切入點(diǎn)，采用目前較常用的篩選雌激素方法——人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，從影響ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞增殖的角度進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：石榴皮、羅勒、鷹嘴豆、枸杞水提物均能使ER陽(yáng)性MCF-7細(xì)胞增殖，提示它們具有擬植物雌激素樣活性，因中藥植物雌激素與雌二醇結(jié)構(gòu)的相似性，可能與雌激素受體相結(jié)合而發(fā)揮一定的雌激素效應(yīng)。該作用與這些中藥所含的木脂素、香豆素、黃酮類成分有關(guān)。

酵母雙雜交技術(shù)是Fields等于1989年提出，是在重組基因酵母法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的環(huán)境雌激素物質(zhì)的檢測(cè)方法［5］，是基于核激素受體和輔激活蛋白之間的配體依賴作用而建立起來(lái)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，雌激素受體（ERs）與酵母轉(zhuǎn)錄子GAL4的DNA結(jié)合域（DNA-BD）結(jié)合，輔激活蛋白與DNA轉(zhuǎn)錄激活域（DNA-AD）結(jié)合，構(gòu)建質(zhì)粒。由于ER與輔激活蛋白相互作用BD與AD在空間上接近，從而激活GAL4的激活序列（UAS）下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的lac-Z報(bào)告基因表達(dá)，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。因此β-半乳糖苷酶的活性大小就和ERs與輔激活蛋白之間的相互作用強(qiáng)度大小一致。但只有在雌激素物質(zhì)存在的情況下，ERs才能和輔激活蛋白結(jié)合，引起B(yǎng)D和AD在空間上接近，從而激活lac-Z報(bào)告基因表達(dá)，產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。根據(jù)這一原理，通過(guò)測(cè)定β-半乳糖苷酶的活性即可反映受試物的雌激素樣作用。 近些年來(lái)，酵母雙雜交法應(yīng)用范圍得到了較大擴(kuò)展，不僅應(yīng)用于檢測(cè)那些用于發(fā)展新牙科聚合物的化學(xué)物質(zhì)的雌激素活性［6］，也同時(shí)應(yīng)用于檢測(cè)和評(píng)價(jià)羥基化多氯聯(lián)苯的雌激素和甲狀腺激素活性［7］，以及評(píng)價(jià)多種化合物的抗雌激素活性［8］和天然藥物的雌激素活性的篩選研究［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：鷹嘴豆、石榴皮水提液均能使酵母系統(tǒng)中β-半乳糖苷酶活性增加，表現(xiàn)出具雌激素樣作用。 有機(jī)體是一個(gè)復(fù)雜的體系，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍需整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。因此，應(yīng)當(dāng)注意在選擇進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，為了避免實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性和假陰性，再進(jìn)一步進(jìn)行傳統(tǒng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以保證獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)論。 本研究用經(jīng)典的E-screen和Yeast Two-Hybrid Assay實(shí)驗(yàn)，篩選了9種受試物的雌激素活性。以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)，石榴皮、鷹嘴豆、羅勒、枸杞均具有雌激素樣活性；以酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)，石榴皮、鷹嘴豆有雌激素樣活性。鼠尾草、肉蓯蓉、鎖陽(yáng)、阿里紅、紅景天在兩種體外實(shí)驗(yàn)篩選中均無(wú)顯示出雌激素樣活性，至于它們是否具有雌激素樣作用還需從其它途徑進(jìn)行研究。