作者：王桂龍 侯玉東 石玲波

【摘要】 目的 探索煙草浸提液對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)的影響。方法 將周齡SD大鼠顱蓋骨，剪成1.5 mm×1.5 mm大小組織塊，先用0.25％胰蛋白酶消化20 min、0.1％Ⅱ型膠原酶消化30 min后，再對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)其堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化能力進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組按所加煙草浸提液濃度的不同分為0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50 g／L 7個(gè)濃度組，分別測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。采用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析。結(jié)果 煙草浸體液對(duì)成骨細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)起抑制作用，并隨其濃度的升高而增強(qiáng)。各處理組間存在顯著差異（P＜0.01）；各組內(nèi)的前3 d存在顯著性差異（P＜0.01），但3.2～50 g／L組第4～7天間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 吸煙不利于口腔種植的臨床愈合。 【關(guān)鍵詞】 成骨細(xì)胞；原代培養(yǎng)；SD大鼠；煙草浸提液 【Abstract】 Objective To investigate the effects of smokeless tobacco extract(ST) on the attachment and growth of the rat’s osteoblasts in vitro.Methods The bone tissues from the calvaria in rats aged 1 week were cut into blocks of 1.5 mm × 1.5 mm.They were digested by 0.25％ trypsinase for 20 minutes and by 0.1％ collagenase II for 30 minutes and then the liquid supernatant was abandoned. The bone blocks were cultured to acquire isolated cells.The identification was conducted by cell morphology，histochemical staining of alkaline phosphatase (ALPase)and calcified nodules staining.The experiments were pided into control group and experiment groups.The experiment groups were pided into seven groups by the smokeless tobacco extract’s concentration: 0.8，1.6，3.2，6.4，12.5，25 and 50 g／L， then the cell growth curves were drawn. Statistical analysis was performed using SPSS13.0 software package for twoway ANOVA.Results ST inhibited attachment and growth of osteoblasts in all groups with a concentrationdependent manner. The difference among all of groups was significant（P＜0.01）; the difference between the same group was significant before 3 days（P＜0.01）， while the difference among 3.250 g／L groups was no significant after 4 days（P＞0.05）.Conclusion Smoking is harmful to the clinic healing of oral implant operation. 【Key words】 osteoblast，primary culture，rats，smokeless tobacco extract 目前，口腔種植技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而獲得了臨床醫(yī)師及患者的青睞，而骨結(jié)合則是其成功的基礎(chǔ)。骨組織作為一種特殊的鈣化組織，主要由成骨細(xì)胞完成并受體內(nèi)多種因素調(diào)控。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)成為可能。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞可以排除體內(nèi)多種因素的相互影響，從而為骨形成和代謝機(jī)理方面的研究提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法主要有2種：酶消化法和組織塊法［1，2］。酶消化法雖可獲得大量細(xì)胞，但獲得的細(xì)胞不純。本實(shí)驗(yàn)擬采用酶消化后再對(duì)組織塊進(jìn)行培養(yǎng)的方法來(lái)獲得純度較高的成骨細(xì)胞，觀察煙草浸提液對(duì)成骨細(xì)胞的附著及生長(zhǎng)的影響，以期證明吸煙是影響口腔種植的不利因素之一。 1 材料和方法 1.1 器材和試劑 1.1.1 主要儀器設(shè)備和材料:超凈工作臺(tái) (蘇州集團(tuán)安泰公司)；CO2培養(yǎng)箱 (Heraeus)；熒光倒置顯微鏡 (日本OLYMLOS)；眼科手術(shù)器械（上海手術(shù)器械廠）；血球計(jì)數(shù)板（鎮(zhèn)江市丹徒科達(dá)醫(yī)療用品廠）；50 ml玻璃培養(yǎng)瓶（Costar）；離心機(jī)（雷動(dòng)爾LDZ52）；高糖DMEM（Ｇibco）；胰蛋白酶（Amresco）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；膠原酶（Invitrogen）；煙草（成品盒裝香煙，煙氣煙堿量1.2 mg，焦油量13 mg）；SD大鼠（煙臺(tái)綠葉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。 1.1.2 主要試劑的配制:①含煙草浸提液培養(yǎng)液的配制［3］:稱取5 g成品盒裝香煙的煙絲，加入0.1 L的雙蒸水，在37℃ 孵育箱中浸泡48 h，過(guò)濾除菌，將此濃度定為50 g／L。用含15 ml／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制含煙草浸提液的培養(yǎng)液，其濃度分別為0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50 g／L 7個(gè)濃度組。②成骨細(xì)胞礦化培養(yǎng)液的配制:DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗(含青霉素100 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3。含礦化液的DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗(含青霉素100 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3、β甘油磷酸鈉1×10-2mol/L、維生素C 50 mg/ml、地塞米松1×10-7mol/L。孵育液含3%β甘油磷酸鈉5 ml，2%巴比妥鈉5 ml，2%硝酸鈣10 ml，2%MgSO4 5 ml，蒸餾水25 ml。 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 大鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)：周齡SD大鼠處死后用75％酒精浸泡5 min，倒置顯微鏡下取其顱頂骨，以無(wú)菌DHanks(含青霉素100 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)沖洗，刮去骨膜、剪去骨縫間結(jié)締組織，制成約1.5 mm×1.5 mm大小的碎塊，以DHanks液沖洗3次，加入0.25% 胰蛋白酶37℃下震蕩消化20 min，棄上清，0.1%的II型膠原酶消化30 min后棄上清；所得骨塊直接放入培養(yǎng)瓶中加入含20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代：在原代培養(yǎng)過(guò)程中，每3～4 d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)開(kāi)始傳代，傳代時(shí)用差速貼壁法進(jìn)行純化［4］。0.25% 胰蛋白酶37℃消化10 min左右，當(dāng)觀察到細(xì)胞形態(tài)變圓，且部分細(xì)胞已開(kāi)始脫離瓶底時(shí)，終止消化，離心后加入培養(yǎng)液進(jìn)行傳代，每瓶細(xì)胞可傳代2～3瓶。傳代3～5次后，成骨細(xì)胞得到純化，用于實(shí)驗(yàn)。 1.2.3 成骨細(xì)胞鑒定：①熒光倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)的變化及生長(zhǎng)狀況每日進(jìn)行觀察。②堿性磷酸酶組織化學(xué)染色(改良Gomori鈣鈷法) 將純化后的第2代細(xì)胞接種于蓋玻片上，接種密度為1×104 /cm2。待細(xì)胞長(zhǎng)至匯合后取出蓋玻片，以常規(guī)Gomori鈣鈷法染色。玻片無(wú)菌沖洗2次后用冷丙酮（4℃冰箱保存）固定細(xì)胞10 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，放人孵育液中37℃孵育4～6 h，然后依次入2％硝酸鈷5 min，蒸餾水沖洗數(shù)次。1%硫化銨中浸2 min，自來(lái)水沖洗，自然晾干，甘油明膠封片。③將第4代成骨細(xì)胞接種爬片，用含礦化液的培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，在倒置顯微鏡下可見(jiàn)白色結(jié)節(jié)， PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min。再用PBS沖洗2次，0.1%茜素紅TrisHCl（pH8.3）染色30 min，用PBS沖洗，晾干、封片。 1.2.4 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：取3瓶體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，用適量0.25%的胰蛋白酶消化10 min，離心后加入25 ml培養(yǎng)基，吹打成細(xì)胞懸液后，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)其濃度為1.35×105/ml。取24孔培養(yǎng)板8塊，滴加細(xì)胞懸液入其內(nèi)，每孔0.1ml，培養(yǎng)10 h使成骨細(xì)胞能貼壁生長(zhǎng)，測(cè)其貼壁率。而后每塊培養(yǎng)板內(nèi)各孔分別加入含不同濃度煙草浸提液的培養(yǎng)基0.9 ml，每濃度組為3孔，細(xì)胞每3 d換液一次。從加入煙草浸提液始每24 h計(jì)數(shù)1次。 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 x±s表示，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 酶消化后對(duì)組織塊繼續(xù)培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)骨塊周圍有少量細(xì)胞長(zhǎng)出，靠近骨塊處圓形細(xì)胞多見(jiàn)，遠(yuǎn)離骨塊處體積較小的梭型細(xì)胞常見(jiàn)；5 d后觀察，細(xì)胞數(shù)量較多，呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，分化成熟者可見(jiàn)有3～4個(gè)突起。傳代后細(xì)胞以梭形、三角形為主，呈集落樣生長(zhǎng)趨勢(shì)，最終可連接成片，出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象（圖1）。 2.2 堿性磷酸酶（ALP）組織染色 ＡＬＰ組織染色（改良Gomori鈣鈷法）測(cè)定為陽(yáng)性，顯示成骨細(xì)胞呈黑灰色著色（圖2）。 2.3 成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色觀察 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)融合成復(fù)層后，不經(jīng)傳代繼續(xù)培養(yǎng)，形成鈣化結(jié)節(jié)后行茜素紅染色，顯微鏡下黑色的結(jié)節(jié)染成紅色 (圖3)。

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