【摘要】 目的： 構(gòu)建人野生型p53腫瘤抑制基因的植物表達(dá)載體，并建立p53轉(zhuǎn)基因煙草植株. 方法： 將人野生型p53腫瘤抑制基因編碼區(qū)克隆于pUC19， pBI426和pCAMBIA2301載體，構(gòu)建含人野生型p53基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA2301/p53，p53基因由2×CaMV 35S啟動(dòng)子控制表達(dá). 利用葉盤(pán)共培養(yǎng)法經(jīng)根瘤農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株；用組織化學(xué)法，PCR、Southern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草植株. 結(jié)果： 經(jīng)組織化學(xué)法，PCR， Southern雜交檢測(cè)表明人野生型p53基因已整合到轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組中，并獲得了的轉(zhuǎn)p53基因煙草植株. 結(jié)論： 成功建立了含人野生型p53基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株，為進(jìn)一步檢測(cè)p53基因的生物活性和開(kāi)辟生產(chǎn)藥用蛋白的新途徑奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 人野生型p53基因；轉(zhuǎn)基因煙草；根瘤農(nóng)桿菌；基因轉(zhuǎn)化；抗菌藥 【Abstract】AIM: To construct the plant transformation vector containing human wildtype p53 tumor suppressor gene and establish human wildtype p53 transgenic tobacco plants. METHODS: The human wildtype p53 coding sequence was subcloned into vectors pUC19， pBI426 and pCAMBIA2301 to obtain plant expression vector pCAMBIA2301/p53. TDNA regions of the pCAMBIA2301/p53 binary vector contained constitutive 2×Cauliflower mosaic virus (2×CaMV) 35S promoter， nopaline synthase terminator， and neomycin phosphotransferase Ⅱ(npt Ⅱ)gene， which allowed the selection of transformed plants against kanamycin. The tobacco (Nicotiana tobacum L.Cuttivar Xanthi) plants were transformed by cocultivating leaf discs method via Agrobacterium tumefaciens EHA105 harboring the plant expression vector. The generated transgenic tobacco plants were selected by kanamycin， and identified by histochemical assay， PCR， Southern blot. RESULTS: Histochemical assay， PCR and Southern blot analyses demonstrated the stable integration of the human wildtype p53 gene into the tobacco genome.Transgenic tobacco plant with p53 gene was obtained successfully. CONCLUSION: Transgenic wildtype p53 tobacco plants have been established， which can serve as a base for further studies on detecting the biological activities of p53 gene and exploiting the new way of producing pharmaceutical proteins. 【Keywords】 human wildtype p53 gene; transgenic tobacco; Agrobacterium tumefaciens; gene transformation; antibacterial agents 0引言 人類(lèi)癌癥中最常見(jiàn)的基因改變是p53基因突變，它是癌基因研究中重要的腫瘤抑制基因之一，野生型p53基因與細(xì)胞周期的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制以及誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡有著密切關(guān)系［1-2］. 本研究利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)，將人野生型p53腫瘤抑制基因構(gòu)建于植物表達(dá)載體，通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)入煙草，獲得表達(dá)人野生型p53基因的轉(zhuǎn)基因植株，為今后借助轉(zhuǎn)基因煙草或其它轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人野生型p53蛋白奠定了基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料 1.1.1質(zhì)粒、菌株人野生型p53腫瘤抑制基因由趙永同博士惠贈(zèng)，植物表達(dá)載體pCAMBIA2301，根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，大腸桿菌（Ecoli.）DH5α，pUC19為本實(shí)驗(yàn)室保存. 1.1.2主要試劑各種限制性酶、Tag聚合酶、質(zhì)粒快速提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；高效地高辛 DNA標(biāo)記檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche Molecular Biochemicals公司. 頭孢曲松鈉購(gòu)自上海先鋒藥業(yè)公司；卡那霉素購(gòu)自華美生物工程公司，其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭? 1.1.3培養(yǎng)基LB及MS 培養(yǎng)基按參考文獻(xiàn)方法配制［3］. 浸染培養(yǎng)基：MS0+ AS（400μmol/L）+ pluronic F68 (0.5 mg/L)，AS和pluronic F68在浸染前加入. 共培養(yǎng)基：MS+BA(1 mg/L)+NAA(0.1 mg/L) + AS (400 μmol/L)+pluronic F68 (0.5 mg/L). 選擇培養(yǎng)基：MS+BA (1 mg/L)+ NAA (0.1 mg/L )+Kanamycin (100 mg/L)+頭孢曲松鈉. 頭孢曲松鈉濃度依次為50 mg/L， 100 mg/L， 150 mg/L， 200 mg/L， 300 mg/L， 400 mg/L， 500 mg/L， 600 mg/L. GUS顯色液按

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