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摘要：目的：大鼠Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其基因結(jié)構(gòu)分析。方法：通過UCSC（http：//genome.ucsc.Edu/）分析大鼠瞬時(shí)受體電位通道4（TRPC4）及其家族基因組結(jié)構(gòu),并通過NCBI確定了TRPC4的蛋白結(jié)構(gòu)域,通過Bio GPS（http：//biogps.org/#goto=welcome）分析其表達(dá)模式;PCR擴(kuò)增大鼠TRPC4蛋白編碼區(qū)域（CDS）,并通過限制性內(nèi)切酶與穿梭載體pDOV-mCMV-MCS-EGFP-3FLAG進(jìn)行連接,其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞;挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,并對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序正確的克隆即為目的質(zhì)粒,命名為pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG;將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒包裝,并命名為Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG,通過Western blot驗(yàn)證蛋白的表達(dá)。結(jié)果：生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)TRPC4蛋白保守的TRP-2、ANK及TRP結(jié)構(gòu)域,通過Bio GPS分析發(fā)現(xiàn)TRPC4在杏仁核和海馬中表達(dá)明顯,在血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá);PCR克隆獲得3 000 bp的TRPC4 CDS序列,CDS被亞克隆到表達(dá)載體pDOV-mCMVMCS-EGFP-3FLAG中,酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證正確;進(jìn)行腺病毒包裝后的病毒可以在HEK293細(xì)胞中表達(dá)TRPC4-EGFP-3FLAG融合蛋白,Western blot證實(shí)其為含flag標(biāo)簽的蛋白且大小為128 KDa。結(jié)論：成功構(gòu)建了大鼠TRPC4的腺病毒表達(dá)載體Ad-pDOV-mCMV-TRPC4-EGFP-3FLAG。

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