茶樹N-甲基轉移酶基因啟動子克隆及功能分析
摘要：咖啡堿是茶葉中重要的功能物質,N-甲基轉移酶(NMT)是其生物合成的關鍵酶。本研究以英紅9號茶樹新梢為材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因啟動子,并采用PlantCARE等在線軟件分析其順式作用元件。根據其元件組成,設計5'遞減的啟動子與GUS基因一起組建了融合載體轉入煙草,利用GUS染色和定量PCR方法,分析了克隆的啟動子功能及其對環境因子的響應。結果表明,克隆的NMT1基因啟動子長767bp,含有TATA-box、CAAT-box等真核生物啟動子基本元件及多個與植物非生物脅迫相關的響應元件。以5'遞減的NMT1啟動子替換pBI121中的CaMV35S啟動子,構建出與GUS融合的pA、pB、pC、pD載體。在煙草葉片中進行瞬時表達,不同長度的NMT1啟動子均具驅動GUS表達功能,且長度越長驅動能力越強。以含全長NMT1啟動子載體pA對煙草轉基因,轉基因煙草各組織均檢測到GUS基因的表達且表達量葉>莖>根,葉片中的表達量為根部的3倍。對轉基因煙草進行不同程度光照、溫度、模擬干旱和脫落酸處理后,除40℃溫度條件外,其他處理的葉片中GUS基因表達在處理前后均存在顯著變化,表明NMT1啟動子功能受外界環境因子的脅迫影響。
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