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摘要：為獲得轉(zhuǎn)錄水平更高的強(qiáng)啟動(dòng)子,提高黑曲霉中重組蛋白表達(dá)量,研究在黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因啟動(dòng)子PglaA基礎(chǔ)上,構(gòu)建分別含2、4、6個(gè)拷貝的正調(diào)控元件片段PglaA2R、PglaA4R、PglaA6R啟動(dòng)子。以黑曲霉木聚糖酶基因xynB為目的基因,研究正調(diào)控元件拷貝數(shù)對(duì)PglaA啟動(dòng)子的影響。構(gòu)建黑曲霉表達(dá)載體pSZHG2R-xynB、pSZHG4R-xynB、pSZHG6R-xynB,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉CICC2462。獲得目的基因表達(dá)框整合在葡萄糖淀粉酶基因位點(diǎn)的純合黑曲霉重組菌株P(guān)glaA2R-xynB、PglaA4R-xynB、PglaA6R-xynB。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)觀察到重組菌株分泌約24.0ku木聚糖酶蛋白條帶。經(jīng)酶活檢測(cè)表明,木聚糖酶活力在第8天達(dá)最高,重組菌株P(guān)glaA4R-xynB(7705.36U mL^-1)、PglaA6R-xynB(8466.32U mL^-1)比PglaA2R-xynB(5890.77U mL^-1)分別提高1.31倍和1.44倍。熒光定量PCR結(jié)果表明,重組菌株P(guān)glaA4R-xynB、PglaA6R-xynB的xynB基因mRNA比PglaA2R-xynB分別提高2.2倍和5.3倍。可知,PglaA啟動(dòng)子正調(diào)控元件多拷貝顯著提高木聚糖酶表達(dá)。

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