【摘要】 目的 通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)納米羥基磷石復(fù)合40%二氧化鋯材料進(jìn)行早期生物相容性評(píng)價(jià)。 方法 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的要求，同時(shí)報(bào)據(jù)納米羥基磷灰石復(fù)合40%二氧化鋯材料的特定用途，選取樣本進(jìn)行如下生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：致敏試驗(yàn)，溶血試驗(yàn)，刺激試驗(yàn)，肌肉植入試驗(yàn)。 結(jié)論 經(jīng)體內(nèi)和體外試驗(yàn)結(jié)果顯示：納米羥基磷灰石復(fù)合40％二氧化鋯材料無(wú)致敏、無(wú)刺激、無(wú)變形，具有良好的血液及生物相容性。

【關(guān)鍵詞】 納米羥基磷灰石 二氧化鋯 生物相容性

由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤以及先天性缺損等原因所致骨缺損在臨床十分常見，傳統(tǒng)修復(fù)骨缺損的方法：如自體骨移植，同種異體骨移植。自體骨取骨量有限，同時(shí)取自體骨痛苦大、后遺癥多、異體骨又有排異反應(yīng)。而人工合成的骨移植材料在一定程度上可以達(dá)到自體骨和異體骨修復(fù)的效果，又可以避免疾病感染和骨源有限等弊端[1]。納米羥基磷灰石與人體骨骼主要無(wú)機(jī)成分相似的化學(xué)組成和晶體結(jié)構(gòu)，它具有良好的生物相容性，對(duì)人體無(wú)毒，又能夠在植入人體后同骨表面形成很強(qiáng)的化學(xué)鍵結(jié)合，有利于骨的長(zhǎng)入[2]。然而它的脆性大、韌性較差、容易發(fā)生斷裂破壞，二氧化鋯陶瓷是一種生物惰性陶瓷，具有良好的生物相容性、較高的彎曲強(qiáng)度、斷裂韌性和較低的彈性模量。正是由于二氧化鋯具有增韌補(bǔ)強(qiáng)的作用，有效的改善納米羥基磷灰石的力學(xué)性能[3]。因此，納米羥基磷灰石復(fù)合40%二氧化鋯陶瓷材料，兼具材料生物活性、骨誘導(dǎo)性以及材料力學(xué)特性，成為用于承載部位骨缺損修復(fù)具有廣泛前景的新興材料。

一、實(shí)驗(yàn)方法

(一) 致敏試驗(yàn)

取豚鼠30只，雌雄各半，體重300—500g，隨機(jī)分為三組，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組各10只。實(shí)驗(yàn)樣品的生理鹽水浸提液，5%甲醛溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水作為陰性對(duì)照[4]。

（二）刺激試驗(yàn)

選用新西蘭白兔，每組3只，雌雄各半隨機(jī)分3組，體重2.5kg-3.0kg。HA/40% ZrO2浸提液，陰性對(duì)照：生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照為3%甲醛溶液。在脊柱左側(cè)取一去毛區(qū)，標(biāo)記5個(gè)點(diǎn)，常規(guī)麻醉消毒用1ml注射器試驗(yàn)組于5個(gè)點(diǎn)每點(diǎn)注射0.1ml的浸提液，陰性對(duì)照組每點(diǎn)注射0.1ml的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組每點(diǎn)注射01.ml的甲醛溶液。

（三）溶血實(shí)驗(yàn)

穿刺抽取人靜脈血10ml加入到含有抗凝肝素鈉的試管中，混合抗凝。取抗凝人血8ml，加入10ml生理鹽水，稀釋備用。取24支干凈玻璃試管每組8支。實(shí)驗(yàn)組每只試管加入材料浸提液10ml，陰性對(duì)照組每只試管加入10ml生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組每只試管加入10ml蒸餾水，將全部試管在37℃恒溫箱中恒溫30分鐘后，每只試管分別加入0.2ml稀釋抗凝人血，輕輕混勻，繼續(xù)保溫60分鐘后，離心5分鐘，吸取上清液至比色皿中，用分光光度計(jì)在545nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

溶血率 =實(shí)驗(yàn)材料的吸光度—陰性對(duì)照的吸光度/陽(yáng)性對(duì)照的吸光度—陰性對(duì)照的吸光度

結(jié)果評(píng)定：若材料的溶血率<5%，說(shuō)明該材料符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；若>5%，則不符合生物醫(yī)用材料溶血試驗(yàn)要求。

（四）肌肉內(nèi)植入試驗(yàn)

選用Wister大鼠48只，雌雄各半，體重220±25g，隨機(jī)分為術(shù)后第7、15、30、90天4組， 每組10只。對(duì)照組8只。常規(guī)麻醉消毒， 分離豎脊肌，于肌肉內(nèi)植入消毒的HA/40% ZrO2材料塊， 縫合肌膜和皮膚。術(shù)后每日予以青霉素20 萬(wàn)U 肌注， 連續(xù)3 d ， 于術(shù)后第7、15、30、90 天取材，對(duì)照組手術(shù)操作如上， 但不放材料板。大體觀察并制作標(biāo)本切片，HE染色，光鏡下觀察。

二、結(jié) 果

(一)致敏試驗(yàn)

各實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組皮膚均無(wú)紅斑、水腫或疹塊發(fā)生，致敏率為0。

但甲醛對(duì)照組動(dòng)物出現(xiàn)顯著的紅斑和水腫，致敏率為100%，致敏作用強(qiáng)

(二)刺激試驗(yàn)

生理鹽水對(duì)照組均未見任何刺激反應(yīng)，試驗(yàn)組3號(hào)兔的第2點(diǎn)24h時(shí)可見淡紅色邊界清晰的紅斑和邊緣明顯高于周圍皮面的輕度水腫，48h時(shí)可見淡紅色邊界清晰的紅斑剛可查出的極輕微的水腫，72h時(shí)可見此點(diǎn)極輕微的紅斑無(wú)水腫。所以24h的平均原發(fā)性刺激指數(shù)為0.267，48h的平均原發(fā)性刺激指數(shù)為0.2，而72h的平均原發(fā)性刺激指數(shù)為0.067，均小于0.4，則說(shuō)明材料對(duì)皮膚無(wú)刺激作用，而甲醛對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)可見嚴(yán)重的紅斑和水腫，為強(qiáng)刺激。

(三)溶血試驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組各管離心后，上層均為清亮無(wú)色液體，下層為紅細(xì)胞沉淀物，該材料的溶血率為3.17%，小于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)5%，說(shuō)明該材料符合組織工程支架溶血試驗(yàn)要求。

經(jīng)SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間光吸收度值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組光吸收度值有顯著性差異（P＜0.05）。 (四)肌肉植入試驗(yàn)

將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包繞納米羥基磷灰石-二氧化鋯材料的組織切開， 植入后7天，試樣周圍可見以嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎性反應(yīng)，可見吞噬細(xì)胞，無(wú)囊壁形成。

植入15天后試樣周圍有少量嗜中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和巨細(xì)胞反應(yīng)；試樣周圍可見小血管與纖維母細(xì)胞增生，開始形成疏松囊壁。

植入30天后，試樣周圍可見少量淋巴細(xì)胞，試樣周圍可見纖維母細(xì)胞與膠原纖維，并已形成纖維囊腔結(jié)構(gòu)。

植入90天后試樣周圍未見或僅見極少量淋巴細(xì)胞，纖維化囊壁致密，壁的厚度比形成初期要薄。

三、討 論

目前，生物醫(yī)學(xué)材料安全性評(píng)價(jià)主要是采用醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體系，即世界標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）制定的10993系列標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)化為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T）16886系列標(biāo)準(zhǔn)。參照以上標(biāo)準(zhǔn)，選擇了（致敏試驗(yàn)、刺激試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、、肌肉植入試驗(yàn)），由于該生物醫(yī)學(xué)材料在體內(nèi)是不降解的，作為異物一定會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生作用，同時(shí)生物體也會(huì)對(duì)植入材料產(chǎn)生排斥反應(yīng)，如果該材料最終被生物體接受，就認(rèn)為該生物材料與組織之間相容，被稱為具有好的生物相容性；反之，被稱為生物不相容。

致敏反應(yīng)屬Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，試驗(yàn)用完全弗氏佐劑和十二烷基硫酸鈉石蠟液起到加強(qiáng)致敏作用的效果，又采取了最大劑量法，保證了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。況且豚鼠為T淋巴細(xì)胞敏感型動(dòng)物，而結(jié)果顯示試驗(yàn)組各注射點(diǎn)均無(wú)紅斑和水腫，證明此材料無(wú)致敏反應(yīng)。

刺激是不涉及免疫學(xué)機(jī)制的一次、多次或持續(xù)與試驗(yàn)組織工程支架材料接觸引起的局部炎癥反應(yīng)。本文使用的是皮膚刺激試驗(yàn)。采用5點(diǎn)注射法，各時(shí)間點(diǎn)平均原發(fā)性刺激指數(shù)均小于0.4，則說(shuō)明材料對(duì)皮膚無(wú)刺激作用，而甲醛對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)可見嚴(yán)重的紅斑和水腫，為強(qiáng)刺激。

溶血試驗(yàn)是檢測(cè)生物醫(yī)用材料對(duì)血液紅細(xì)胞的溶血作用，測(cè)定紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離的程度。本實(shí)驗(yàn)采用直接接觸法，該材料的溶血率為3.17%，小于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)表明該材料不引起溶血反應(yīng)。此試驗(yàn)對(duì)吸光度數(shù)值先用單因素方差分析，結(jié)果為p〈0.05，說(shuō)明三組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，多組間均數(shù)的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，結(jié)果為試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間p〉0.05，說(shuō)明與陰性對(duì)照組之間無(wú)差別，而與陽(yáng)性對(duì)照組之間p〈0.05，說(shuō)明試驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組之間有顯著差別。

體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)是為了評(píng)價(jià)活體組織與試驗(yàn)樣品材料的相互反應(yīng)。所有醫(yī)療器械和材料植入體內(nèi)均會(huì)不同程度地產(chǎn)生組織反應(yīng)。目前，常采用肌肉局部組織生物學(xué)反應(yīng)評(píng)價(jià)是根據(jù)炎性細(xì)胞反應(yīng)和纖維囊形成進(jìn)行組織反應(yīng)分級(jí)，然后在根據(jù)組織反應(yīng)分級(jí)情況進(jìn)行結(jié)果評(píng)定。本試驗(yàn)植入各個(gè)時(shí)期炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維囊形成分級(jí)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)體內(nèi)和體外試驗(yàn)結(jié)果表明納米羥基磷灰石復(fù)合40%二氧化鋯陶瓷材料是一種無(wú)致敏、無(wú)刺激、無(wú)溶血，具有良好的血液和組織相容性的材料，又因其材料本身具有良好的生物活性及力學(xué)特性，有望成為修復(fù)骨缺損十分重要的生物材料。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] MuruganR，RamakrishnaS.Development of nanocomposites for bonegrafting.Compos.Sci.Technol.，2005，65(15-16):2385-2406.

[2] 胡江.組織工程研究進(jìn)展.2000.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，17(1):75-79

[3] 李世普.《生物醫(yī)學(xué)材料導(dǎo)論》，武漢工業(yè)大學(xué)出版社，2000.

[4] 郝和平.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施指南[M].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.81～135.